一种检测人idh1基因突变的探针法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别涉及一种检测人IDH1基 因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原 发肿瘤的一半，广义上是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义上则是指源于各类胶质细胞的 肿瘤。通用WHO分级根据非典型性、核分裂指数、内皮细胞增殖和坏死程度分为4级：1级： 以良性毛细胞型星形细胞瘤为主，占胶质瘤5%左右，通常可以治愈；II级：为一般的星形 细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤，占胶质瘤的30~40%左右；III级：为间变型星形细胞 瘤，占胶质瘤的15~25%左右，一般由II级演变而来；IV级：为胶质母细胞瘤，占胶质瘤的 1/3左右。低级别的胶质瘤在临床上主要是指WHO分类为星形细胞瘤I与II级，也包括少 突胶质细胞瘤及混合性少突星形细胞瘤。
[0003] 异柠檬酸脱氢酶（IDH)家族包括以NAD或NADP为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化 脱羧反应生成α-酮戊二酸的酶类，同时分别生成NADH或NADPH。在哺乳动物细胞中，IDH 同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2,依赖NADP的胞 质IDH3。编码依赖NAD的人IDH1的IDH1基因位于染色体2q33. 3,并且定位于细胞质和 过氧化物酶体中；编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26. 1。尽管 IDH1和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制，但IDH1在脂质的代谢机制中也发挥了 重要作用。
[0004] 大量研究证实，代谢的异常是引发肿瘤发生、发展的因素之一。IDH基因突变发生 在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的IDH基因高度保持一致。一般认为，IDH基因状态不 会因治疗而发生变化。IDH基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40%， 胰腺癌为90%以上，肺癌约为15%。IDH1基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13 密码子R>H(彡90% )称为R132H，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使 得IDH1蛋白处于持续活性状态。美国国家综合癌症网络（NCCN)临床实践指南（第二版， 2014)将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别胶质瘤患者风险级别的指标之一。
[0005] 以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学，但仅靠组织形态学，特别是立体 定向取材小标本，使组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异型性、血管增生、坏死 等进行分级。当取材为肿瘤（尤其是低级别胶质瘤）边缘，或肿瘤治疗后判断是否存在复 发情况时，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生就显得十分困难。而直接测序法检测 基因突变则存在步骤繁琐、工序复杂、费时费力的不足。而本发明采用的荧光定量PCR方法 是分子诊断领域应用的一种技术，该方法灵敏度高、可实时定量，是适合临床大规模使用的 方法。
[0006] 本发明还结合了扩增阻碍突变系统（amplificationrefractorymutation system，ARMS)ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物 延伸是3'端开始的，所以3'末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据这个原理，将突 变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3'最末端，当反应进行时，如果引物3'末 端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3'，5' -磷酸二 酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。
【发明内容】
[0007] 为了实现对人IDH1基因突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供参考， 本发明提供了一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其试剂盒， 该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的IDH1基因突变检测 体系。
[0008] -种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCR Taqman探针法，包括以下步骤：
[0009] (1)在IDH1R132H PCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因 组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
[0010] 所述IDH1R132HPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如 序列表中SEQIDNo. 1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所 示序列的IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1R132H探针、 具有如序列表中SEQIDNo. 4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 5所 示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo. 6所示序列的内参探针；
[0011] (2)结果判断：根据人类基因组DNA在R132H反应体系进行荧光定量PCR扩增时 的突变Ct值进行分析。
[0012] -种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，所述样品可以是 利用脑胶质瘤样本术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，包括：间 变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和少量 正常脑组织、垂体瘤组织样本。
[0013] 一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中R132H反应 体系为：在16-20μ1IDH1R132HPCR反应混合液中加入1-4μ1、浓度为3-10ng/μ1的人 类基因组DNA，优选在18μ1IDH1R132HPCR反应混合液中加入2μ1、浓度为10ng/μ1的 人类基因组DNA ;所述IDH1R132HPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所 述IDH1R132H上游引物的浓度为2-4μΜ，优选3μΜ ;所述IDH1R132H下游引物的浓度为 2-4μ Μ，优选3μ Μ ;所述IDH1R132H探针的浓度为2-4μ Μ，优选3μ Μ ;所述内参上游引物的 浓度为1-3μΜ，优选2μΜ ;所述内参下游引物的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ ;所述内参探针 的浓度为1-3μ Μ，优选2μ Μ。
[0014] 一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中PCR的扩增 过程为：37°C3min;95°C3min;95°C15s，65°C45s，14 个循环；95°C15s，60°C45s，24 个循 环，在60°C45s阶段收集荧光。
[0015] -种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCR Taqman探针法，其中结果判断步 骤中Ct值进行分析为：
[0016] 当R132H反应体系中的内参R0X信号呈现"S"曲线、内参扩增曲线10彡Ct彡14 时，可以判断待测样本R132H突变的阴性和阳性：当R132H反应体系中的ΛCt< 9时为 R132H突变阳性；当R132H反应体系中ΛCt>9时为R132H突变阴性，其中ΛCt=待测样品 扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值。
[0017] 一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中IDH1R132H PCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预 混液中的浓度为0. 05-0. 8μM，优选0. 2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓 度为 0· 005-0. 02U/μ1，优选 0· 01U/μ1。
[0018] -种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，还使用了弱阳性 对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为IDH1R132H突变率为10 %的人类基因组 DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有IDH1R132H突变的阳性质粒溶解在没 有IDH1R132H突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有IDH1R132H突变的人 类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有R132H突变的人类基因组DNA在弱阳性对照 液中的核酸总浓度为2-10ng/μ1，优选为10ng/μ1 ;所得水溶液与IDH1R132H突变率10% 的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和 扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。
[0019] 一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μ1，优选 18μ1的IDH1R132HPCR反应混合液中加入1-4μ1，优选2μ1的弱阳性对照液，形成R132H 反应体系的阳性质控反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
[0020] 一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μ1，优选 18μ1的IDH1R132HPCR反应混合液中加入1-4μ1，优选2μ1的空白对照液，形成R132H 反应体系的空白对照反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
[0021] -种检测人IDH1基因突变的试剂盒，包括IDH1R132HPCR反应混合液，其中所 述IDH1R132HPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中 SEQIDNo. 1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所示序列的 IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1R132H探针、具有如序 列表中SEQIDNo. 4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 5所示序列的 内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo. 6所不序列的内参探针。
[0022] -种检测人IDH1基因突变的试剂盒，其中所述IDH1R132HPCR反应混合液中各组 分在PCR预混液中的浓度为：所述IDH1R132H上游引物的浓度为2-4μM，优选3μΜ;所述 IDH1R132H下游引物的浓度为2-4μΜ，优选3μΜ;所述IDH1R132H探针的浓度为2-4μΜ， 优选3μΜ;所述内参上游引物的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ;所述内参下游引物的浓度为 1-3μΜ，优选2μΜ;所述内参探针的浓度为1-3μΜ，优选2μΜ。
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