肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及诊断技术领域，特别是涉及一种肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种（型）， 其中以肠道病毒71型（EV71)和柯萨奇病毒A16型（CoxA16,CA16)最为常见。二者所致 的手足口病临床上难以区分，与CA16型不同的是，EV71型不仅可以引起手足口病，更为重 要的是其能够引起严重中枢神经并发症，如脑炎、脑膜炎、急性迟缓性瘫痪等，甚至导致死 亡。目前缺乏有效治疗药物主要对症治疗。
[0003] 肠道病毒引起的手足口病、病毒性脑炎等疾病的潜伏期一般为3天~7天，没有明 显的前驱病症，而表现为多数病人突然发病。所以，早诊断、早治疗就显得尤为重要。目前 传统的检测方法是，将咽拭子或粪便标本送至实验室检测病毒，但病毒检测需要2周~4周 才能出结果，且存在操作繁琐，敏感性低，远远达不到对于疾病预防的"四早"要求。
[0004] 随着分子生物学技术的迅速发展，应用聚合酶链反应技术为病原微生物的检测提 供了新的方向，特别是近几年来兴起的实时荧光定量PCR。该方法通过对荧光信号的检测实 现对PCR过程中产物量的实时监测，并可以精确计算出初始模板量。该法除定量准确、检测 快速外，其最大的优点在于采用了闭管检测，避免了交叉污染，广泛被科研和临床所接受。 [0005] 目前暂未报道用于区分EV71型肠道病毒和CA16型肠道病毒的肠道病毒实时荧光 定量检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 基于此，有必要提供一种能够用于区分EV71型肠道病毒和CA16型肠道病毒的肠 道病毒实时荧光定量检测试剂盒。
[0007] -种肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒，用于区分EV71型肠道病毒和CA16型肠 道病毒，包括：
[0008] 用于扩增EV71型肠道病毒的上游引物EV71F1，用于扩增EV71型肠道病毒的下游 引物EV71R1，用于检测EV71型肠道病毒的探针EV71P1，所述探针EV71P1的两端分别结合 有第一荧光基团和第一荧光猝灭剂；
[0009] 用于扩增CA16型肠道病毒的上游引物CA16F2,用于扩增CA16型肠道病毒的下游 引物CA16R2,用于检测CA16型肠道病毒的探针CA16P2,所述探针CA16P2的两端分别结合 有第二荧光基团和第二荧光猝灭剂，所述第一荧光基团与所述第二荧光基团不同；以及
[0010] 实时荧光定量PCR反应缓冲液。
[0011] 在一个实施例中，所述上游引物EV71F1的序列为SEQIDNo. 1所示的序列，所述 下游引物EV71R1的序列为SEQIDNo. 2所示的序列，所述探针EV71P1的序列为SEQID No. 3所示的序列。
[0012] 在一个实施例中，所述探针EV71P1的5'端结合有第一荧光基团，所述探针EV71P1 的3'端结合有第一荧光猝灭剂，所述第一荧光基团为ROX，所述第一荧光猝灭剂为BHQ1。
[0013] 在一个实施例中，所述上游引物CA16F2的序列为SEQIDNo. 4所示的序列，所述 下游引物CA16R2的序列为SEQIDNo. 5所示的序列，所述探针CA16P2的序列为SEQID No. 6所示的序列。
[0014] 在一个实施例中，所述探针CA16P2的5'端结合有第二荧光基团，所述探针CA16P2 的3'端结合有第二荧光猝灭剂，所述第二荧光基团为J0E，所述第二荧光猝灭剂为BHQ1。
[0015] 在一个实施例中，还包括用于扩增非竞争性内标的内标上游引物F3、用于扩增非 竞争性内标的内标下游引物R3以及用于检测非竞争性内标的内标探针P3,所述内标探针 P3的两端分别结合有第三荧光基团和第三荧光猝灭剂，所述第三荧光基团与所述第一荧光 基团不同并且所述第三荧光基团与所述第二荧光基团不同。
[0016] 在一个实施例中，所述内标上游引物F3的序列为SEQIDNo.7所示的序列，所述 内标下游引物R3的序列为SEQIDNo. 8所示的序列，所述内标探针P3的序列为SEQID No. 9所示的序列。
[0017] 在一个实施例中，所述内标探针P3的5 '端结合有第三荧光基团，所述内标探针P3 的3'端结合有第三荧光猝灭剂，所述第三荧光基团为FAM，所述第三荧光猝灭剂为BHQ1。
[0018] 在一个实施例中，还包括工作标准品、阳性对照品和阴性对照品。
[0019] 在一个实施例中，所述工作标准品为核酸浓度为IX103~IX106拷贝的线性梯度 模板，所述阳性对照品为EV71型肠道病毒灭活病毒株的RNA提取物，所述阴性对照品为无 菌去离子水。
[0020] 这种肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒能够用于EV71型肠道病毒和CA16型肠道 病毒的区分，用这种肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒对样本进行处理后，如果能够检测 到第一荧光基团的信号，而没有第二荧光基团的信号，则说明样本中含有EV71型肠道病毒 并且不含有CA16型肠道病毒；如果能够检测到第二荧光基团的信号，而没有第一荧光基团 的信号，则说明样本中含有CA16型肠道病毒并且不含有EV71型肠道病毒；如果能够检测到 第一荧光基团和第二荧光基团的信号，则说明样本中同时含有CA16型肠道病毒和EV71型 肠道病毒；如果能够同时没有检测到第一荧光基团和第二荧光基团的信号，则说明样本中 不含有CA16型肠道病毒并且不含有EV71型肠道病毒。
【附图说明】
[0021 ] 图1为核酸浓度从1X103~1X10 6拷贝的工作标准品线性梯度扩增曲线；
[0022] 图2为图1的标准曲线。
【具体实施方式】
[0023] 下面主要结合附图及具体实施例对肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒做进一步 的解释说明。
[0024] -实施方式的肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒，用于区分EV71型肠道病毒和 CA16型肠道病毒。
[0025] 肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒包括：
[0026] 用于扩增EV71型肠道病毒的上游引物EV71F1，用于扩增EV71型肠道病毒的下游 引物EV71R1，用于检测EV71型肠道病毒的探针EV71P1，所述探针EV71P1的两端分别结合 有第一荧光基团和第一荧光猝灭剂；
[0027] 用于扩增CA16型肠道病毒的上游引物CA16F2,用于扩增CA16型肠道病毒的下游 引物CA16R2,用于检测CA16型肠道病毒的探针CA16P2,探针CA16P2的两端分别结合有第 二荧光基团和第二荧光猝灭剂，第一荧光基团与第二荧光基团不同；以及
[0028] 实时荧光定量PCR反应缓冲液。
[0029] 本实施例中，上游引物EV71F1的序列为SEQIDNo. 1所示的序列，下游引物 EV71R1的序列为SEQIDNo. 2所示的序列，探针EV71P1的序列为SEQIDNo. 3所示的序 列。
[0030] 探针EV71P1的5'端结合有第一荧光基团，探针EV71P1的3'端结合有第一荧 光猝灭剂，第一荧光基团为R〇X(Carboxy-X-Rhodamine)，第一荧光猝灭剂为BHQ(BLACK HOLEQUENCHER? )系列非荧光染料BHQ1。
[0031] 在其他的实施例中，第一荧光基团和第一荧光猝灭剂也可以选择其他物质。
[0032] 本实施例中，上游引物CA16F2的序列为SEQIDNo. 4所示的序列，下游引物 CA16R2的序列为SEQIDNo. 5所示的序列，所述探针CA16P2的序列为SEQIDNo. 6所示的 序列。
[0033] 探针CA16P2的5'端结合有第二荧光基团，探针CA16P2的3'端结合有第二荧光 猝灭剂，第二荧光基团为J0E(2, 7-二甲基-4, 5-二氯-6-羧基荧光），第二荧光猝灭剂为 BHQ(BLACKHOLEQUENCHER?)系列非荧光染料BHQ1。
[0034] 第一荧光猝灭剂和第二荧光猝灭剂可以相同，也可以不同，本实施例中，二者相 同。
[0035] 在其他的实施例中，第二荧光基团和第二荧光猝灭剂也可以选择其他物质。
[0036] 实时荧光定量PCR反应缓冲液可以为Tris-HCl的终浓度为10mmol/L~65mmol/ L，硫酸铵的终浓度为10mmol/L~20mmol/L，氯化钾的终浓度为40mmol/L~80mmol/L，硫 酸镁的终浓度为2mmol/L~5mmol/L，Tween20与反应缓冲液的体积比为0. 01~0. 05。
[0037] 这种肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒能够用于EV71型肠道病毒和CA16型肠道 病毒的区分，用这种肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒对样本进行处理后，如果能够检测 到第一荧光基团的信号，而没有第二荧光基团的信号，则说明样本中含有EV71型肠道病毒 并且不含有CA16型肠道病毒；如果能够检测到第二荧光基团的信号，而没有第一荧光基团 的信号，则说明样本中含有CA16型肠道病毒并且不含有EV71型肠道病毒；如果能够检测到 第一荧光基团和第二荧光基团的信号，则说明样本中同时含有CA16型肠道病毒和EV71型 肠道病毒；如果能够同时没有检测到第一荧光基团和第二荧光基团的信号，则说明样本中 不含有CA16型肠道病毒并且不含有EV71型肠道病毒。
[0038] 本实施例中，上述肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒还包括用于扩增非竞争性内 标的内标上游引物F3、用于扩增非竞争性内标的内标下游引物R3以及用于检测非竞争性 内标的内标探针P3。
[0039] 内标探针P3的两端分别结合有第三荧光基团和第三荧光猝灭剂，第三荧光基团 与第一荧光基团不同并且第三荧光基团与第二荧光基团不同。
[0040] 本实施例中，内标上游引物F3的序列为SEQIDNo.7所示的序列，内标下游引物 R3的序列为SEQIDNo. 8所不的序列，内标探针P3的序列为SEQIDNo. 9所不的序列。
[0041]内标探针P3的5'端结合有第三荧光基团，内标探针P3的3'端结合有第三荧光 猝灭剂，第三荧光基团为FAM，第三荧光猝灭剂为BHQ1。
[0042] 第一荧光猝灭剂、第二荧光猝灭剂和第三荧光猝灭剂可以相同，也可以不同，本实 施例中，三者相同。
[0043] 本实施例中，上述肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒还包括工作标准品、阳性对 照品和阴性对照品。
[0044] 工作标准品为核酸浓度为1X103~1X10 6拷贝的线性梯度模板，阳性对照品为 EV71型肠道病毒灭活病毒株的RNA提取物，阴性对照品为无菌去离子水。工作标准品和阳 性对照品使用时用无菌去离子水稀释至1X1〇3~1X10 6拷贝。
[0045] 优选的，上述肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒还包括反应酶系。反应酶系包括 TaqDNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
[0046] 这种肠道