固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶的制作方法
【专利说明】固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶
[0001] 本发明涉及固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶和其中使用固定化的脯氨酸特异 性内切蛋白酶的啤酒制备方法。
[0002] 背景
[0003] 脯氨酸特异性内切蛋白酶是可源自细菌和真菌的酶；例如如W02002/046381中所 公开的来自Aspergillus niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶能 够在蛋白链中包含脯氨酰基-残基的位置切割蛋白。W02002/046381公开了 ：所述脯氨酸 特异性内切蛋白酶可被用于减少饮料例如啤酒中的混浊（haze)。啤酒中的混浊主要由蛋白 质-多酚聚集体组成。为了减少混浊，可在发酵期间或在啤酒的稳定化期期间，将脯氨酸特 异性内切蛋白酶加入到麦芽汁中。
[0004] W02005/027953公开了：当在浆化（mashing)或啤酒发酵期间加入脯氨酸特异性 内切蛋白酶时，脯氨酸特异性内切蛋白酶降低了啤酒中的谷蛋白水平。
[0005] 为了能够在例如啤酒生产过程中重复使用脯氨酸特异性内切蛋白酶， W02003/104382中建议：使酶固定化并使酶残存在终产物中的风险最小化。
[0006] 几十年前就已知了酶的固定化（参见"Immobilization of Enzyme and Cells"， 第二版，Jose M.Guisan编，2006, Humana Press Inc.)。最常见的酶固定化程序是共价偶 联、包埋、微囊化和交联。
[0007]然而，尚未公开用于脯氨酸特异性内切蛋白酶的合适的固定化，其中酶在部分或 全部不溶的底物上保持活性，所述底物例如是在啤酒中形成混浊的蛋白质-多酚聚集体或 者谷蛋白。
[0008] 本发明的目标是在不溶性底物上有充分的活性的固定化的脯氨酸特异性内切蛋 白酶。
[0009]
[0010] 本公开涉及固定在载体上的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，所述载体包含粒 径范围为100-400 μπι的氨基官能化的甲基丙烯酸酯。出乎意料地，已发现：本文所公开的 固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶不仅在大的底物例如谷蛋白上保持其酶活性，而且在较 低的温度下显示出比游离酶在该较低温度下的相对活性更高的相对活性。
[0011] 本公开还涉及生产固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶的方法，所述方法包括：用 双官能交联剂激活氨基官能化的甲基丙烯酸酯载体中的氨基基团，以〇. 01-0. 07重量/重 量的酶：载体比率使氨基官能化的甲基丙烯酸酯载体上的脯氨酸特异性内切蛋白酶固定 化，以及生产固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶。
[0012] 本公开还涉及生产啤酒的方法，所述方法包括：制备浆体、发酵啤酒和使啤酒稳定 化，其中将所述啤酒与固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶一起孵育。
[0013] 详细说明
[0014] 本文公开了固定在载体上的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，所述载体包含氨 基官能化的甲基丙烯酸酯聚合物。优选地，固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶的粒径范 围为100-400 μπι。优选地，包含氨基官能化的甲基丙稀酸酯聚合物的载体的粒径范围为 150-350 μ m之间。优选地，甲基丙烯酸酯聚合物已用二亚甲基氨基官能化。
[0015] 有利地，本文所公开的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶被固定在孔径分布d50 为1500 - 2100A、例如孔径分布d5〇为1600 - 2000A的载体上。孔径分布d50是本领 域技术人员已知的术语，其被定义为累积分布中50%的孔直径的值。
[0016] 通常，用于固定化脯氨酸特异性内切蛋白酶的氨基官能化的甲基丙烯酸酯载体的 表面积大于40m 2/g，例如大于45m2/g，或者大于50m2/g。用于固定化脯氨酸特异性内切蛋白 酶的甲基丙烯酸酯载体的保水性通常为58-70 %，例如60-68 %，或者62-66 %。保水性在本 文中被定义为完全水化的载体的重量和完全干燥的载体的重量之间的比率。
[0017] 出乎意料地，已发现：本文所公开的固定在载体上的脯氨酸特异性内切蛋白酶不 仅在大的聚合底物和/或蛋白质-多酚聚集底物例如混浊（例如啤酒混浊）上保持活性， 而且还能够水解谷蛋白，例如大麦谷蛋白。
[0018] 本文所公开的固定在载体上的具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的酶可以是能 够在蛋白质或肽链中包含脯氨酰基-残基的位置切割肽或蛋白质的任何合适的酶。脯氨 酸特异性内切蛋白酶可源自细菌或真菌来源，例如源自Flavobacterium、Sphingomonas、 Aeromonas、Xanthomonas、Bacteroides、Aspergillus 或 Penicillium 属，例如源自 Flavobacterium meningosepticum、Sphingomonas capsulata、Aspergillus niger 或 Penicillium chrysogenum。本文所公开的脯氨酸特异性内切蛋白酶属于酶分类EC 3. 4. 21. 26。脯氨酸特异性内切蛋白酶优选地是这样的酶，其水解脯氨酸残基的羧基末端的 肽键，从而产生具有C-末端脯氨酸的肽和/或多肽片段。
[0019] 词语"固定化的"在本文中用于表示酶附着在载体（例如甲基丙烯酸酯载体）上。 可通过酶吸附、包埋或交联在载体上或酶吸附、包埋或交联到载体上来实现酶的固定化，这 是本领域技术人员已知的（参见"Immobilization of Enzyme and Cells"，第二版，Jose M. Guisan 编，2006, Humana Press Inc.) 〇
[0020] 本公开提供通过交联固定在甲基丙烯酸酯载体上的脯氨酸特异性内切蛋白酶。
[0021] 在一个实施方式中，本公开涉及生产本文所公开的固定化的脯氨酸特异性内切蛋 白酶的方法，所述方法包括：用双官能交联剂激活氨基官能化的甲基丙烯酸酯载体中的氨 基基团，将脯氨酸特异性内切蛋白酶固定在载体上以及生产固定化的脯氨酸特异性内切蛋 白酶。
[0022] 出乎意料地，已发现：使用本文所公开的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶的方 法将产生固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，其在较低的温度下具有比游离酶的相对活性 更高的相对活性。
[0023] 甲基丙烯酸酯载体可以用例如二亚甲基间隔（spacer)或六亚甲基间隔（优选六 亚甲基间隔）进行氨基官能化。
[0024] 通过双官能交联剂激活氨基官能化的甲基丙烯酸酯中的氨基基团导致酶被固定 到载体上。优选地，交联剂是戊二醛。可以以本领域技术人员已知的任何合适方式用戊二 醛激活氨基基团。
[0025] 在将酶固定到载体上期间，可应用任何合适的酶：载体比率，例如0. 01-0. 07重量 /重量的比率，或者〇. 02-0. 06重量/重量的酶：载体比率，或者0. 03-0. 05重量/重量的 酶：载体比率。已发现：在本文所公开的固定化方法中，在所指出的酶：载体比率下，获得了 在甲基丙烯酸酯载体上的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，所述酶具有比得上游离酶的 活性。
[0026] 优选地，本文所公开的用于固定脯氨酸特异性内切蛋白酶的方法在10°C -50°C， 例如15°C -40°C之间，例如20°C -30°C之间的温度下进行。
[0027] 本文所公开的用于固定脯氨酸特异性内切蛋白酶的方法可在任何合适的pH下进 行，例如6-8之间的pH或者6. 7-7. 5之间的pH。可使用将pH维持在期望水平的任何缓冲液， 例如具有在20-150mM之间，或者在40-120mM之间，或者在60-100mM之间，例如在70-90mM 之间的盐浓度的缓冲液。合适的缓冲液可以例如是磷酸盐缓冲液。
[0028] 本文所公开的用于固定化脯氨酸特异性内切蛋白酶的方法可进行4-48小时，例 如8-36小时或者10-24小时。
[0029] 在一个实施方式中，本公开涉及本文所公开的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶 用于水解谷蛋白（例如大麦谷蛋白）的用途。
[0030] 谷蛋白是在小麦、黑麦、大麦和燕麦中发现的一组富含脯氨酸和谷氨酰胺的蛋白， 其可被细分为麦谷蛋白和醇溶谷蛋白。仅谷蛋白的醇溶谷蛋白级分使谷蛋白不耐受人群和 /或患乳糜泻的人群产生过敏反应。不同谷物中的醇溶谷蛋白通常在小麦中被表示为小麦 醇溶蛋白、在大麦中被表不为大麦醇溶蛋白、在黑麦中被表不为黑麦醇溶蛋白、在燕麦中被 表示为燕麦醇溶蛋白。为了实现本公开的目的，词语"小麦醇溶蛋白"可被用于表示所有不