B-细胞cll/淋巴瘤11a(bcl11a)的寡核苷酸调节剂及其用图
【专利说明】B-细胞CLL/淋巴瘤11A(BCL11A)的寡核苷酸调节剂及其 用途
[0001] 背景
[0002] 血红蛋白病是与血红蛋白机能障碍相关的疾病。通常，这些疾病涉及血红蛋白的 缺失或出现功能障碍的血红蛋白，其源自球蛋白基因（例如，α，β，等；图1)的遗传突变。 血红蛋白病是一组广谱的红血细胞相关病症，特征为在多数情况下为常染色体显性遗传的 单基因遗传病症。据估计，约7%的世界人口是携带者。遗传的血红蛋白病以三种形式之一 显现：地中海贫血（α，β，δ)、镰状细胞病和遗传性胎儿血红蛋白持续存在症（HbF)。镰 状细胞病（SCD)和β-地中海贫血是血红蛋白病的最常见形式并且是世界范围内发病和死 亡的主要原因。SCD，如名称暗示的，涉及由突变形成的球蛋白结构的改变并且导致出现功 能障碍的血红蛋白，而地中海贫血与导致正常球蛋白生产不足的球蛋白基因突变相关。这 可以经由调节蛋白的突变发生。贫血，在一些情况下是血红蛋白机能障碍的常见结果。
[0003] 随时间，已经开发了血红蛋白病的各种治疗。主要焦点通常是在恢复血红蛋白功 能，例如，通过增加胎儿血红蛋白（HbF)的水平。然而，尚未成功开发出很多有效的治疗。近 来，关于调节HbF的机制的理解已经成为很多研究的领域。据报道，BCL11A在骨髓中成人 红细胞前体细胞中表达并行使功能，以抑制y-球蛋白产生（Sankaran等人2008Science 第 322 卷，第 1839-1842 页）。
[0004]W0 2010/030963描述了使用针对4条靶序列的siRNA样品池（pool)调节BCL11A。 关于个体靶序列是否能够下调BCL11A，没有表明。
[0005]W0 2012/079046描述了靶向BCL11A基因的双链核糖核酸（dsRNA)组合物。
[0006] 概述
[0007] 本发明提供BCL11A的反义寡核苷酸调节剂（例如，抑制剂）和基于这样的调节剂 治疗BCL11A-相关疾病、病症或病况的方法和组合物，以及其它事项。考虑到的是，本发明 提供的反义寡核苷酸对于治疗血红蛋白病、如镰状细胞病和β-地中海贫血特别有用。
[0008] 在一个方面，本发明提供一种能够下调或减少人BCL11A表达的反义寡核苷酸，其 具有与选自SEQIDNO1的人BCL11A基因或BCL11A的信使RNA(mRNA)同种型的核苷酸410 至450的区域内的连续序列的反向互补物至少80% (例如至少约85%，90%，95%，96%， 97%，98%，或99% )相同的序列，其中所述反义寡核苷酸是gapmer。在一些实施方案中， 本发明的反义寡核苷酸长度小于19个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸 长度小于18个核苷酸。
[0009] 在一个方面，本发明提供一种能够下调或减少人BCL11A的表达的反义寡核苷酸， 其具有小于18个核苷酸（例如，小于17,16,15,14,13,或12)的长度并且具有与选自SEQ IDNO1的人BCL11A基因或BCL11A的信使RNA(mRNA)同种型的核苷酸410至450的区域 内的连续序列的反向互补物至少约80% (例如，至少约85%，90%，95%，96%，97%，98%， 或99% )相同的序列。
[0010] 在一个方面，本发明提供一种能够下调或减少人BCL11A表达的反义寡核苷酸，所 述反义寡核苷酸具有与选自SEQIDNO1的人BCL11A基因或BCL11A的信使RNA(mRNA) 同种型的核苷酸410至450的区域内的连续序列的反向互补物至少约80% (例如，至少约 85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%)相同的序列并且由式乂3^,表示，其中父是 核苷酸类似物；Y是连续的DNA序列；a是1，2,3,4或5 ;a'是1，2,3,4或5 ;并且b是5和 15之间的整数。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物是锁定核酸（LNA)。
[0011] 在一些实施方案中，a和V不同。在一些实施方案中，a和V相同。在一些实 施方案中，a和/或V是1。在一些实施方案中，a和/或V是2。在一些实施方案中，a 和/或V是3。在一些实施方案中，a和/或V是4。在一些实施方案中，a和/或V 是5。
[0012] 在一些实施方案中，b是包括5和15之间的整数。在一些实施方案中，b是包括5 至10的整数。在一些实施方案中，b是包括7至11的整数。在一些实施方案中，b是选自 由以下各项组成的组的整数：5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14和15。
[0013]在一些实施方案中，BCL11A的同种型选自由以下各项组成的组：XL，L，M，S和XS或其同源物或直向同源物。在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸能够下调或减少小 鼠BCL11A基因的表达。
[0014]在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含或含有至少一个，至少两个，至少 三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个或更多个核苷类似物。在一些实 施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。 在一些实施方案中，至少一个所述核苷酸类似物是锁定核酸（LNA);例如至少3或至少4,或 至少5,或至少6,或至少7,或8个核苷酸类似物可以是LNA。在一些实施方案中，所有的核 苷酸类似物可以是LNA。
[0015]在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含或含有至少一个，至少两个，至少三 个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个或更多个LNA单元。在一些实施方 案中，所述一个或多个LNA单元位于反义寡核苷酸的5'和/或'3末端。在一些实施方案 中，本发明的反义寡核苷酸在5'和/或'3末端包含至少一个，至少两个或至少三个LNA单 元。在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸在内部包含至少一个，至少两个或至少三个 LNA单元。
[0016]在一些实施方案中，所述一个或多个LNA单元是β-D-氧基-LNA核苷酸。在一些 实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含一种以上另外的化学修饰。在一些实施方案中，本 发明的反义寡核苷酸包含一种以上另外的化学修饰，所述化学修饰包括2'0_甲基修饰和/ 或硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少一个LNA单元，所述 LNA单元是LNA5-甲基胞嘧啶核苷酸。
[0017] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有10-17,10-16,10-15,10-14， 10-13,10-12,11-17,11-16,11-15,11-14,11-13,12-17,12-16,12-15,或 12-14 个核苷酸 的长度。在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有12-16个核苷酸的长度。
[0018]在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有与选自SEQIDNO1的人BCL11A基因或人BCL11A的信使RNA(mRNA)同种型的核苷酸410至450的区域内的连续序列的反 向互补相同的序列。
[0019]本发明的一个备选方面是一种能够减少人BCL11A表达的反义寡核苷酸，所述反 义寡核苷酸包含与选自人BCL11A基因的核苷酸1-283 (外显子1)，核苷酸284-613 (外显 子2)，或核苷酸614-715 (外显子3)的区域内的连续序列的反向互补物至少80%相同的序 列。
[0020] 在一些实施方案中，根据本发明的连续序列在人BCL11AmRNA同种型XL的核苷酸 410-450 内。
[0021] 在一些实施方案中，根据本发明的连续序列在人BCL11AmRNA同种型XL的核苷酸 415-436 内。
[0022] 在一些实施方案中，根据本发明的连续序列在人BCL11AmRNA同种型XL的核苷酸 420-450 内。
[0023] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含选自由以下各项组成的组的序列基 序或由选自由以下各项组成的组的序列基序组成：5'-ATTGCATTGTTTCCG-3'（SEQIDN0: 63)，5'-GTTTGTGCTCGAT-3'（SEQIDN0:64)，5'-CATTGCATTGTTTCCG-3'（SEQIDN0: 65)，5'-CGTTTGTGCTCGAT-3'（SEQIDN0:66)，5'-CGTTTGTGCTCGATAA-3'（SEQIDNO: 67)，5 ' -CCGTTTGTGCTCGA-3'（SEQIDN0:68)，5'-CGTTTGTGCTCGA-3'（SEQIDNO: 69)，5'-TTTGTGCTCGATAA-3'（SEQIDN0:70)，5'-TTGTGCTCCATAA-3'（SEQIDN0:71) 和 5'-TTTCCGTTTGTGCTCG(SEQIDN0:72)，5'-ATTGCATTGTTTCCGT-3'（SEQIDN0:73)， 5'-CGTTTGTGCTCGAIA-3'（SEQIDN0:74)。
[0024] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有选自表2的序列s
[0025] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有选自以下各项的序列：SEQID NO：11,SEQIDNO ：15,SEQIDNO ：32,SEQIDNO ：21,SEQIDNO ：34,SEQIDNO：10,SEQ IDNO: 12,SEQIDNO: 13,SEQIDNO: 14,SEQIDNO: 16,SEQIDNO: 17,SEQIDNO: 18， SEQIDNO：19,SEQIDNO：20,SEQIDNO：22,SEQIDNO：23,SEQIDNO：24,SEQIDNO： 25,SEQIDNO：26,SEQIDNO：27,SEQIDNO：28,SEQIDNO：29,SEQIDNO：30,SEQID NO：31,SEQIDNO ：33,SEQIDNO ：35,SEQIDNO ：36,SEQIDNO ：37,SEQIDNO：38,SEQ IDNO：39,SEQIDNO-A0,SEQIDNO：41,SEQIDNO：42,SEQIDNO：43,SEQIDNO：44, SEQIDNO：45,SEQIDNO：46,SEQIDNO：47,SEQIDNO：48,SEQIDNO：49,SEQIDNO： 50,SEQIDNO：51,SEQIDNO：52,SEQIDNO：53,SEQIDNO：54,SEQIDNO：55,SEQID NO：56,SEQIDNO：57,SEQIDNO：58,SEQIDNO：59,SEQIDNO：60,SEQIDNO：60,SEQ IDNO:61 或SEQIDNO:62，
[0026] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸选自5' _mCs°As°Ts°tsgscsa ststsgststst smC s0mCs0G0-3,(SEQIDNO：11), 5?-n,Cs0Gs0T s0tstsgstsg scstsmcsgsa sTs0As0A0-3,(SEQIDN0：15)gSc 5，-mCs°Gs°Ts°tstsgst sgsCstsmCsgsA；Ts°A°-3,（SEQIDNO:32)，5，-T；Ts°Gs°tsgsCsts mCsgsastsAs°As0A。 -3'（SEQIDNO:14)和 5'-mCs〇Gs〇Ts〇tstsgst sgscstscsGs〇AsT-3'（SEQIDNO:35)，其中大写字 母表示锁定核酸（LNA)单元，下标"s"表示硫代磷酸酯键，并且小写字母标示脱氧核糖核苷 酸（DNA)单元，"mC"表示Y甲基-胞嘧啶LNA单元，并且"mc"表示Y甲基-胞嘧啶DNA 单元。
[0027] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸是5' -mCs0A s0Ts0tsgsc saststsgstst stsmCs0m Cs0G0-3'（SEQIDNO:11) 〇
[0028] 在另一个方面，本发明提供能够下调或减少人BCL11A基因表达的反义寡核苷酸， 所述反义寡核苷酸具有与选自表2的寡核苷酸序列至少80% (例如，85%，90%，91%， 92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更多）相同的序列。
[0029] 在一些实施方案中，根据本发明的反义寡核苷酸具有与选自以下各项的寡核苷酸 序列至少 80% (例如，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更 多）相同的序列 （SEQIDN0:ll)，5'-mCs〇Gs〇Ts。 IDNO：15)gg5,-mCs0G s0Ts°tstsgst sgscstsmcsg sAs〇Ts〇A〇-3,(SEQIDN0：32),5,-mCsoG soTsotstsg stsgscstsmc sgsAs〇Ts〇A〇-3,(SEQID gstsgsCst sCsGs〇As〇r-3,（SEQIDN0:35)，5'-Ts〇Ts〇Gs〇tsgsCsts mcsgsastsAs〇As〇A〇-3,（SEQIDNO: 14)和 5'-mCs°Gs°Ts°tstsgst sgsCstscsGs°As°T°-3'（SEQIDN0:35)，其中大写字母表示锁定核酸 (LNA)单元，下标"s"表示硫代磷酸酯键，并且小写字母标示脱氧核糖核苷酸（DNA)单元， "mC"表示Y甲基-胞嘧啶LNA单元，并且"mc"表示Y甲基-胞嘧啶DNA单元。
[0030] 在一些实施方案中，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的反义 寡核苷酸和药用载体。
[0031] 除其它事项外，本发明提供抑制受试者中BCL11A的方法，所述方法包括向需要治 疗的受试者施用本文所述的反义寡核苷酸或药物组合物。
[0032] 除其它事项外，本发明提供一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸用于抑制 BCL11A的方法中，所述方法包括向需要治疗的受试者施用本文所述的反义寡核苷酸或药物 组合物的步骤。
[0033] 在一些实施方案中，本发明提供本发明的反义寡核苷酸或药物组合物用于制造药 物的用途，所述药物用于治疗贫血疾病、病症或病况，如镰状细胞病或地中海贫血。尤 其在制造用于抑制BCL11A的药物方面，包括向受试者施用本文所述的反义寡核苷酸或药 物组合物。
[0034] 在一些实施方案中，本发明提供根据本发明的药物组合物的反义寡核苷酸，其用 作药物，如用于治疗贫血疾病、病症或病况，如镰状细胞病或β-地中海贫血。
[0035] 在一些实施方案中，本发明提供一种在受试者中治疗贫血疾病、病症或病况的方 法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用本文所述的反义寡核苷酸或药物组合物。
[0036] 在一些实施方案中，本发明提供一种反义寡核苷酸，其用于治疗疾病或病症，如本 文提及的那些，如血红蛋白病（hemoglobinopathie)，如贫血疾病\病症或病况，如地中海 贫血（α，β，δ)，镰状细胞病和遗传性胎儿血红蛋白持续存在症（HbF)。
[0037] 在一些实施方案中，本发明提供一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸用于在受 试者中治疗贫血疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用本文所 述的反义寡核苷酸或药物组合物。在一些实施方案中，本发明的治疗方法还包括施用向受 试者施用第二药剂，用于治疗疾病或病症，如用于治疗贫血疾病、病症或病况。
[0038] 在一些实施方案中，通过本发明的方法治疗的贫血疾病、病症或病况是镰状细胞 病。
[0039] 在一些实施方案中，通过本发明的方法治疗的贫血疾病、病症或病况是地中 海贫血。
[0040] 在一些实施方案中，施用所述反义寡核苷酸或所述药物组合物导致在一种以上靶 组织中减少的BCL11A表达。在一些实施方案中，施用所述反义寡核苷酸或所述药物组合 物导致一种以上靶组织中增加的γ-球蛋白表达。在一些实施方案中，施用所述反义寡核 苷酸或所述药物组合物导致一种以上靶组织中增加的胎儿血红蛋白产生。在一些实施方案 中，一种以上靶组织选自骨髓、肝、肾、脾、浆细胞、胸腺、扁桃体上皮、红细胞系祖细胞、多能 干细胞、树突状细胞和/或外周血B-细胞。在一些实施方案中，静脉内施用反义寡核苷酸 或药物组合物。在一些实施方案中，皮下施用反义寡核苷酸或药物组合物。
[0041] 在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的反义寡核苷酸或药物组合物的容 器。在一些实施方案中，以单一剂型提供本发明的反义寡核苷酸或药物组合物。在一些实 施方案中，以多种（例如，两种、三种、四种、五种或更多种）剂型提供本发明的反义寡核苷 酸或药物组合物。在一些实施方案中，以冻干形式提供本发明的反义寡核苷酸或药物组合 物。在一些实施方案中，以液体形式提供本发明的反义寡核苷酸或药物组合物。
[0042] 在一些实施方案中，所述容器选自安瓿瓶、小瓶、筒、储器、二室注射器 (lyo-ject)、和预充式注射器。在一些实施方案中，所述容器是预充式注射器并且任选地选 自带有烘过的硅酮涂层的硼硅酸盐玻璃注射器，喷涂有硅酮的硼硅酸盐玻璃注射器，和无 硅酮的塑料树脂注射器。
[0043] 如本申请中使用的，术语"约（about) "和"大约（approximately) "等同使用。本 申请中使用的任何数字，带有或不带有约（about)/大约（approximately)，意为覆盖相关 领域中普通技术人源理解的任何正常波动。
[0044] 本发明的其它特征、目的和优势在接着的详细描述中显而易见。然而，应该理解该 详细描述，在表明本发明的实施方案的同时，仅通过说明的方式给出，但不限制。从该详细 描述，本发明范围内的各种改变和改进对于本领域技术人员将变得显而易见。
[0045] 附图简述
[0046] 附图仅用于说明的目的，不用于限制。
[0047]图1显示对于正常个体（左）和具有β球蛋白链机能障碍的个体（右）中的不 同球蛋白链，总血红蛋白（y-轴）相对妊娠和出生后周龄（X-轴）的百分数的典型的说明。 从Cecil Medicine 第 23 版，Lee W. Goldman，Dennis A. Ausiello. W. Β· Saunders Elsevier 2008.第167章·图167-2改变和改进的。
[0048] 图2显示三种主要的人BCL11A同种型（S、L和XL)的不按比例的示意图。如在各 个同种型中发现的，从5'至3'标记外显子。
[0049] 图3显示由靶向BCL11A的401反义寡核苷酸以25μΜ的浓度在人REH细胞中对 BCL11A-XLmRNA表达的典型的抑制。
[0050] 图4显示由选择的靶向BCL11A的反义寡核苷酸以范围从0. 0064至20μΜ的寡核 苷酸浓度在人RH1细胞中对BCL11A-XLmRNA表达的典型的抑制。
[0051] 图5显示由选择的从革巴向BCL11A的oligo4(顶部）和5(底部）设计的反义寡 核苷酸，以范围从〇. 25至60μΜ的寡核苷酸浓度在人REH细胞中对BCL11A-XLmRNA表达 的典型的抑制。
[0052] 图6显示由选择的反义寡核苷酸以范围从0. 25至60μΜ的浓度对人RH1细胞中主 要同种型（S、L和XL)的BCLllAmRNA表达的典型的抑制。对于各个治疗组中的各个浓度， BCL11AXL、L和S同种型的mRNA的测量分别显示在左、中和右栏中。
[0053] 图7显示由选择的反义寡核苷酸以范围从0. 08至20μΜ的浓度对小鼠MPC-11 细胞中小鼠BCL11AmRNA表达的典型的抑制。对于各个治疗组内的各个浓度，所有同种型 (BCL11A-A11)和同种型L(BCLllA-L)的小鼠BCL11A的测量分别显示在左和右栏中。
[0054] 图8显示用15mg/kg选择的靶向BCL11A的反义寡核苷酸剂量给药的雌性NMRI小 鼠的组的骨髓（顶部）和脾（底部）中BCL11AmRNA表达的典型的抑制。骨髓的测量，对 于各个反义寡核苷酸治疗组，包括所有同种型（左栏）和同种型L(右栏）。
[0055] 图9显示用25或15mg/kg的选择的革巴向BCL11A的反义寡核苷酸施用后四周，野 生型C57BL/6小鼠骨髓中BCL11AmRNA的典型的抑制。
[0056] 图10显示施用以25或15mg/kg的选择的革巴向BCL11A的反义寡核苷酸后八周，野 生型C57BL/6小鼠的骨髓中BCL11AmRNA的典型的抑制。
[0057] 图11显示施用以15mg/kg的选择的革E1向BCL11A的反义寡核苷酸后八周，人 β-YAC转基因小鼠的骨髓中BCLllAmRNA的典型的抑制。
[0058] 图12显示施用以15mg/kg的选择的革E1向BCL11A的反义寡核苷酸后八周，人 β-YAC转基因小鼠的Terll9+和CD19 +骨髓细胞群体中BCL11AmRNA的典型的抑制。
[0059] 图13显示在不同治疗日，执行静脉切开手术的（phleb.)和未执行静脉切开手术 的治疗组中的非人灵长类动物的外周血中典型的总血红蛋白（g/L)。表明载体对照（盐水） 和候选寡核苷酸4(10和20mg/kg)治疗组。
[0060] 图14显示在不同治疗日，执行静脉切开手术的（phleb.)和未执行静脉切开手术 的治疗组中的非人灵长类动物的外周血中网织红细胞的典型的百分数。表明载体对照（盐 水）和候选寡核苷酸4(10和20mg/kg)治疗组。
[0061] 图15显示在研究的第七周，以20mg/kg用载体对照（盐水）或候选寡核苷酸4剂 量给药的执行静脉切开手术的非人灵长类动物的肱骨骨髓中相对GAPDH标准化的典型的 BCL11A表达。对于各个治疗动物，显示对于同种型XL(左栏）和所有同种型（右栏）的测 量。
[0062] 图16显示在研究的第七周以20mg/kg用载体对照（盐水）或候选寡核苷酸4剂 量给药的执行静脉切开手术的非人灵长类动物的肱骨骨髓中相对GAPDH标准化的典型的γ-和β-球蛋白mRNA表达。对于各个治疗组内的各个动物显示人γ-球蛋白（γΑ+G，栏 1)，猕猴（Macacamulatta)γ-球蛋白（HBG2,栏 2)，猕猴β-球蛋白（ΗΒΒ，栏 3 栏 4)的测量。
[0063] 图17显示在研究的第17周对于对照（盐水）和候选寡核苷酸4(10和20mg/kg) 治疗组的执行静脉切开手术的非人灵长类动物的肱骨（顶部）和股骨（底部）骨髓中相对 GAPDH标准化的BCL11AmRNA的典型的表达。对于各个治疗组内的各个动物，显示同种型 XL(左栏）和所有同种型（右栏）的测量。
[0064] 图18显示在研究的第17周对于对照（盐水）和候选寡核苷酸4(10和20mg/kg) 治疗组的执行静脉切开手术的非人灵长类动物中肱骨（顶部）和股骨（底部）骨髓中相 对GAPDH标准化的γ-球蛋白mRNA的典型的表达。对于各个治疗组中的各个动物显示人 γ-球蛋白（γΑ+G，左栏）和猕猴γ-球蛋白（HBG2,右栏）的测量。
[0065]图19显示在第17周，执行静脉切开手术的非人灵长类动物的对照（盐水）和候 选寡核苷酸4 (10和20mg/kg)治疗组的肱骨骨髓中相对GAPDH标准化的γ-和β-球蛋 白mRNA的典型的表达。栏从左至右分别是对于各个治疗组中的各个动物的人γ-球蛋白 (γA+G)，猕猴γ-球蛋白（HBG2)，猕猴β-球蛋白（RhHBB)，和猕猴β-球蛋白（RhHBB_mH) 的测量。
[0066] 图20显示在第17周，执行静脉切开手术的非人灵长类动物的对照（盐水）和候 选寡核苷酸4 (10和20mg/kg)治疗组中的股骨骨髓中相对GAPDH标准化的γ-和β-球 蛋白mRNA的典型的表达。栏从左至右分别是对于各个治疗组中的各个动物人γ-球蛋白 (γA+G