使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法
【专利说明】使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是申请日为2013年3月15日、申请号为61/789，984的临时专利申请的非临时专利申请。
[0003]关于联邦研究或发展资助的申明
[0004]无
[0005]以光盘形式提交的相关参考资料
[0006]无
[0007]发明背景
[0008](1)本发明的领域
[0009]本发明涉及扩增一含有短核酸片段的片段化的目标核酸的方法。具体地，使用一拼装模板拼装和延伸这些短核酸以产生用于进一步操作的更大的扩增子。
[0010](2)【背景技术】描述
[0011]有许多样本类型的目标核酸被严重降解，导致标准分子的诊断试验难以检测目标核酸。更具体地，这些目标核酸比所述用于检测它们的试验的“足迹”更短。譬如，为了检测一拷贝数非常低的目标，一般会扩增所述目标。另外，在许多情况下，会期望高度特异地检测所述目标。这一检测常常在一单核苷酸变化的分辨率上。实行扩增时，如PCR反应，存在一正向引物、一反向引物和一检测探针。通常地，这些引物和所述检测探针至少在长度上约为20个核苷酸。假设所述引物和探针不存在部分重叠，那么要求所述目标至少在长度上为60个核苷酸以容纳这三个原件(即所述试验的足迹)的结合。而且，所述将被检测的期望的单核苷酸变化(SNV)可发生于所述目标核酸序列的任何位置。为了可靠地检测，所述单核酸变化必须定位在所述扩增的目标核酸之中(即在所述引物结合位点之内的所述扩增子的一区域之内)以使所述探针选择性地与该区域杂交。这有效地增加所述试验的所述潜在足迹到至少约100核苷酸的长度以用于该种检测。
[0012]在很多情况下，检测一在所述目标序列中的已知或未知的SNV要求进行所述检测的片段长达160个核苷酸。这在很大程度上归因于探针、引物和封闭探针在所述扩增子上的排列。
[0013]这一需求的挑战在于许多样本类型含有短至20-50个核苷酸长度的片段，通常归因于所述目标DNA或RNA的部分降解。这在RNA序列中是典型的，因为它们更容易降解。这也常见于特殊的样本类型，如尿液、血液样本，和进行甲醛固定石蜡包埋(FFPE)的、细针抽吸(FNA)的样本，其中交联的核酸随着储存变得降解程度更大。在尿液的情况下，由于通过肾脏的处理，核酸天生的以小片段的形式进入尿液。通常地，穿过所述肾脏的核酸片段的大小约为20-50个核苷酸或更小。
[0014]因此，需要延伸短目标片段的长度以进行更为有效率和准确的检测。这需要所述被扩大的目标短片段具有与所述短片段原始来源的序列具有相同的序列背景以使得进行适当的处理成为可能。本发明提供了方法以实现这一需要。发明概要
[0015]本发明提供了使用拼装模板扩增一片段化的目标核酸的方法，所述拼装模板结合并延伸一目标核酸的短核酸片段以产生更大的扩增子来进行进一步操作。本发明的一方面是一扩增一含有短目标核酸片段的片段化的目标核酸的方法，因为其长度原因难以使用现有的技术扩增。在一实施方案中，所述片段化的目标核酸与一含有一与所述目标核酸基本上互补、却有显著不同的序列的拼装序列混合。一群短目标核酸片段退火与所述拼装序列结合，所述短目标核酸片段通过聚合酶在3’方向延伸以产生一群含有一群第一核酸和所述拼装序列的第一双重核酸。
[0016]所述一群第一双重核酸从所述拼装序列解离，所述一群第一核酸退火与一含有一与所述拼装引物的一区域相同的序列的第一引物结合，所述第一引物位于待检目标区域的5’端(拼装序列的同义链)。在一些情况下，所述引物位点恰好位于所述拼装序列的5’末端。所述引物向其3’端方向衍生一产生一群第二核酸。所述第一和第二核酸解离并又退火与所述拼装序列及自身之间相结合，并通过聚合酶分别向其3’端延伸。重复该步骤，从而在由所述拼装序列的5’端的所述第一引物与同所述拼装序列最接近3’端的大部分区域互补的所述目标核酸片段所产生的边界内延伸并线性扩增所述短片段化的目标核酸。
[0017]在第二方面，一旦实现了拼装，所述方法进一步包括，在所述拼装序列存在时通过使用能够检测罕见的遗传事件实验方法对所述目标序列特异性的基因变体的检测。
[0018]在一实施方案中所述拼装序列是一野生型拼装序列。
[0019]在第二实施方案中，所述拼装序列是基因组DNA或其特异于所述所关注的目标的一部分。在一些实施方案中，所述基因组DNA或其部分是人基因组DNA。在另一些实施方案中，所述基因组DNA或其部分与特定的生物体如病毒、细菌、寄生虫和真菌有关。
[0020]在第三实施方案中，所述拼装序列可为所述目标核酸序列的一片段和/或其他任意的但是已知的序列。
[0021]在第四实施方案中，所述拼装序列含有突变体和野生型序列的基因变异。在该应用中，一旦经过拼装，突变体(遗传变异序列)或野生型序列就可以用下游的分析方法在一相对于所述拼装序列的野生型序列与一相对于所述拼装序列的基因变异存在时被确定。同样，在平行反应中野生型和基因变异的拷贝的普遍程度和/或拷贝数能够被确定。
[0022]在所有情况下，所述拼装序列被设计为通过3’端延伸扩大所述目标核酸的短核酸片段以检测一目标核酸的一区域。
[0023]在第六实施方案中，所述拼装序列是双链的。
[0024]在第七实施方案中，同时使用正向引物和反向引物在PCR条件下进行所述拼装。
[0025]在第八实施方案中，多重线性扩增循环被用于线性地拼装短核酸片段，而不会发生在同时存在正向引物和反向引物时，所述拼装序列在指数扩增条件下扩增。
[0026]在第九实施方案中，拼装在更低的温度下进行以帮助短核酸与所述拼装序列杂交，一旦发生拼装，所述扩增温度可被升高，并可添加其他试剂以支持指数扩增。
[0027]在第十实施方案中，进行两个拼装反应，一个反应使用一所关注的检测区域3’端的引物，另一个则使用一所关注的检测区域的5’端的引物。一旦在所述两个分开的反应混合物中发生拼装，可以将它们结合用正向和反向引物进行指数扩增。
[0028]在第十一实施方案中，当所述片段化的核酸浓度更高时，所述拼装反应可与聚合酶链式反应(PCR)同时进行。
[0029]在另一实施方案中，所述拼装序列超过所述用于拼装的核酸片段预期浓度的10、100、1000、10000 或 100000 倍。
[0030]本发明的其他方面参见于所述说明书的全文中。
[0031]图片简述
[0032]图1是本发明中一个方面的示意图。
[0033]除非另有说明，此处所用的所有术语都与本发明所属的本领域技术人员所通常理解的含义相同。此处公开全文所引用的所有专利、专利申请和出版物都以它们全文的形式被引用。若此处的某一术语含有多重的定义，则以本部分最通常的定义为准。
[0034]此处所用术语“寡核苷酸”指核苷酸的一聚合物形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核酸，含有天然或非天然的核苷酸，长度至少为2，通常在约5至约200，或者更常见地至约100。因此，该术语包含双链和单链DNA和RNA。此外，寡核苷酸可抗核酸酶，包括但不限于2’ -0-甲基核糖核苷酸、硫代核苷酸、二硫代核苷酸、磷酰胺核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。
[0035]此处所用术语“目标”、“目标序列”或者“目标核苷酸”指一含有一所关注的多聚核苷酸的核酸，需要对其进行纯