截短型丙型肝炎病毒hcvns3抗原及其制备与应用

文档序号:9500722阅读:470来源:国知局
截短型丙型肝炎病毒hcv ns3抗原及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种丙型肝炎病毒抗原及其制备与应用,尤其设及一种截短型丙型肝 炎病毒HCVNS3抗原及其制备与应用,属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒化巧atitisCvirus,HCV)感染最显著的临床特征就是引起慢性感 染,约有70%的丙肝有可能发展成慢性肝炎,20%发展成肝硬化,12%发展成肝癌,危害十 分地严重。全球HCV的感染率为2. 8%,约有1.85亿人携带HCV。我国属于HCV低流行区, 预计我国HCV感染者1000万,而且每年的新发病例数不断上升。
[0003] 自1989年HCV基因获得克隆W来,人们一直在致力于HCV相关疫苗的研究工作。 HCV基因组长约9. 6化,编码一个长约3000个氨基酸残基的多聚蛋白前体,在宿主信号肤 酶和病毒自身编码蛋白酶的作用下生成4种结构蛋白(C、E1、E2、P7)和6种非结构蛋白 (NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但因病毒RNA在血液含量较低且非常不稳定,HCV基 因组变异率较高,病毒准种多,缺乏理想的体外感染细胞模型,而导致预防性疫苗缺乏保护 性抗体。由于目前没有有效治疗丙型肝炎的药物,因此早期发现HCV感染,准确判断病毒亚 型及患者感染状况,是有效防控丙肝的重要手段。目前,我国控制该疾病蔓延的手段主要采 用血液筛查,运也使得研究开发快速灵敏的丙型肝炎病毒检测试剂盒具有十分重要的临床 意义。
[0004] 已报到的有关肥V检测的ELISA试剂盒主要包含C区、NS3区、NS4区的抗原,有的 也包含NS5区的抗原。但对NS5区抗原作用的评价,却褒贬不一。
[0005] Core、C33(NS3)抗原在抗原反应性上有很好的互补性。其联合检出率平均值可在 99%左右,是研究HCV诊断试剂的重点区段。NS3基因位于HCV全基因序列的3420-53^nt 位点,编码含有631aa(l〇26-1656aa)的NS3蛋白p72,其氨基酸序列相对保守,与黄病毒 及攝病毒相应区段有较高的同源性。NS3蛋白具有多种蛋白酶活性,在病毒多蛋白前体的 加工及各蛋白的转化成熟过程中均发挥重要作用,非结构区各蛋白的产生均有赖于该蛋白 对病毒多蛋白前体的酶解和修饰。免疫学研究发现,NS3蛋白的抗原性和免疫原性相对较 强,是检测HCV感染的主要抗原之一,在诱导机体的抗病毒免疫方面也有一定的意义。感 染者对NS3的抗体反应不仅出现早,且滴度高、特异性强,抗体转阳时间一般为8周左右, 几乎与抗HCV同步。目前,单片段HCV-NS3抗体的检出率为76. 47%-89. 47%。在经对丙 型肝炎病毒的免疫学信息研究发现,HCV在患者血液中的抗体主要是对W下抗原表位的免 疫应答产生,Core(2-120aa),NS3 (1026-1457aa),NS4 (1694-1735aa),NS4 (1859-1931aa), NS5A(2212-2313aa)。但在应用中,存在诊断试剂加入的NS3全长基因表达的蛋白过大,与 其它优势抗原表位串联表达后,会因空间结构的遮挡而使部分抗原失去活性的缺陷。基于 此,寻找和确立与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符合率高、灵敏度高的截短型丙型肝 炎病毒HCVNS3抗原,对开发更加有效的早期诊断丙型肝炎病毒HCV的多克隆抗体或单克 隆抗体和丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒具有重要意义。

【发明内容】

[0006] 针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种截短型丙型肝炎病毒HCV NS3 抗原及其制备与应用。
[0007] 为实现上述目的,本发明人查找阅读国内外HCV NS3文献,并根据HCV sequences dat油ase (ht1:p:/Aepatitis. ibcp. fr.),筛选出6条分属于HCV 6种基因型的NS3抗原序 列,通过序列对比、分析,筛选得到NS31252-1526aa截短型HCV NS3氨基酸序列,查找NCBI 得到对应核巧酸序列,并进一步选择大肠杆菌的偏好性密码子设计并合成截短型NS3抗原 基因核巧酸序列。
[0008] 本发明所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原,其特征在于:所述抗原是HCV基因 组中NS3全长基因编码的第1252~1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列,其氨基酸序列如 SEQIDNO. 1所示,对应核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示;与SEQIDNO. 2所示的核巧酸序 列编码相同序列的蛋白质,但因遗传密码的简并性而与SEQIDNO. 2的核巧酸序列不同的 序列;对所述SEQIDNO. 2所示核巧酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的 核巧酸序列。
[0009] 上述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原,优选是HCV基因组中NS3全长基因编码 的第1252~1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列,其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示,对应 核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 本发明公开了一种用于表达权利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的 大肠杆菌优化密码子,其特征在于:所述密码子核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示,其编码的 氨基酸对应SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列编码的氨基酸。
[0011] 本发明所述截短型丙型肝炎病毒HCV NS3重组抗原蛋白制备方法,步骤是:
[0012] (1)构建用于表达权利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的大肠杆菌 优化密码子,其核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示; 阳01引 似将所述密码子基因片段经BamHI和化〇1双酶化酶切产物纯化回收后,与经同 样限制性内切酶酶切后的表达载体祀T28a连接,获得重组表达质粒(构建的表达载体需用PCR法鉴定,W证明截短型NS3抗原基因片段已获正确插入);
[0014] (3)通过化C12法将制得的重组表达质粒转入大肠杆菌感受态D册α,涂布于含 50 μ g/mlKan+的LB琼脂培养基上,筛选得到阳性质粒; 阳〇1引 (4)将步骤做中得到的阳性质粒,通过化C1进转入大肠杆菌E.coli化21触如 感受态细胞,涂布于含Kan+的LB琼脂培养基上,常规培养;挑取单菌落接种至Kan+的LB液 体培养基中,培养过夜;次日,转接于新鲜的含Kan+的LB液体培养基中,培养至0成。。> 0. 6 时加入IPTG至终浓度为0. 2-0. 8mM,37°C诱导培养12-1化,获得含HCVNS3重组抗原蛋白 的全菌液(取全菌液进行SDS-PAGE鉴定,证明截短型NS3重组抗原已得到高效表达),经过 亲和儀柱层析纯化和离子交换柱纯化,即得到高纯度的截短型HCVNS3重组抗原。
[0016] 一种多克隆抗体或单克隆抗体,其特征在于:所述抗体是能与截短型丙型肝炎病 毒HCVNS3抗原特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体。
[0017] 将制得的截短型HCV NS3重组抗原蛋白免疫小鼠(注射小鼠),经常规单克隆抗体 制备方法,纯化分离,即可制备出所述重组抗原特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体。
[0018] 或者用制得的截短型HCVNS3重组抗原包被酶联板,采用间接酶联免疫法建立抗 HCVNS3抗体技术,检测其临床意义。
[0019] 本发明所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原在制备丙型肝炎病毒HCV抗原或抗 体检测试剂盒中的应用。
[0020] 本发明所述多克隆抗体或单克隆抗体在制备检测丙型肝炎病毒HCV抗原试剂盒 中的应用。
[0021] 本发明所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原和其多克隆抗体或单克隆抗体,可 W用于开发丙型肝炎病毒HCV抗原或抗体检测试剂盒或作为其他HCV检测产品的重要原 料,对更加有效的开发早期诊断丙型肝炎病毒HCV的多克隆抗体或单克隆抗体和丙型肝炎 病毒抗体检测试剂盒提供了支持。
[0022] 申请人经过分析NS3全长基因片段,将NS3基因分成2段分别表达,1026-1251aa, 1252-1526aa,通过基因重组的方法,分别制备出2段重组抗原。经活性检测,1252-1526aa 片段重组蛋白具有高灵敏度、高特异性特点。用其检测HCV抗体,与随机丙型肝炎病毒RNA 阳性患者的检出符合率高达97%。预示该抗原可W应用于多克隆抗体、单克隆抗体、丙型肝 炎病毒检测试剂盒,尤其是丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的制备,具有良好的临床应用前 景。
[0023] 与现有技术比,本发明技术具有W下特点:
[0024] 1、截短型HCVNS3重组抗原的筛选是通过生物信息学技术实现的
[0025] 本发明利用生物信息学技术,根据HCV6种基因型氨基酸序列同源性,对大量HCV NS3序列进行筛选,最终得到1条序列保守的截短型HCVNS3重组片段。 阳0%] 2、截短型HCVNS3重组抗原具有极高的阳性血清覆盖率
[0027] 本发明将截短型HCVNS3重组序列,通过大肠杆菌偏好性密码子优化后表达,最大 限度减小了NS3蛋白分子量,保持了截短型HCVNS3重组抗原的生物活性,进而可W结合不 同HCV基因型HCV感染者血清中的HCVNS3抗体。在临床上适用于检测不同HCV基因型 HCV感染者筛查工作,不易造成漏检。
[0028] 3、截短型HCVNS3重组抗原应用于丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒的研制
[0029] 目前,我国主要采取血液筛查来达到控制HCV蔓延的目的。现用的丙型肝炎病毒 抗体检测试剂盒主要包被抗原包括C区、NS3区、NS4区的抗原,有的也包含NS5区。但其 存在漏检现象,分析其中单个NS3抗原其检出率为76. 47% -89. 47%。相信通过加入本发 明截短型HCVNS3重组融合抗原,可W有效减少丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒漏检现象,在 临床上具有很大的应用前景和推广价值。
【附图说明】
[0030] 图1 :纯化后截短型肥VNS3重组抗原SDS-PAGE。
[0031] 其中:左泳道为样品,右泳道为Mark。
【具体实施方式】
[0032] W下实施例用于进一步阐述本发明,但不用来限制本发明范围。若未特别指明,实 施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
[0033] 实施例1 :截短型
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