源于缅甸蟒的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制备与应用

文档序号:9500734阅读:830来源:国知局
源于缅甸蟒的cathelicidin家族广谱抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域,设及一种源于细甸憐蛇(P^honmolurus bivitta化s)的cathelicidin家族广谱抗微生物肤Pb-CATH4及其编码基因,氨基酸序列和 其在化妆品、保健品、食品、饲料等日化添加剂及抗感染医药领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 化thelicidin是一类由N端信号肤区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特 异的成熟肤区域构成的具有多功能的宿主抗菌肤家族,结构特点是:具有N端信号肤区域 (30个残基左右)、中间保守cathelin结构域巧9-114个残基)和C端高度特异的成熟肤 区域(12-100个残基)。化thelicidin具有广谱的抗菌活性,能快速、广谱地杀灭多种病原 微生物,包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、寄生虫和病毒等,特别是对许多临床耐药细 菌同样具有作用,运引起了人们的注意。除此之外,cathelicidin还具有许多其他生物学 活性,如对多种免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞)具有趋化作用、诱导 肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨隧细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异 细胞系细胞调亡和淋己细胞活化等。运些优势使其在临床的应用有着良好的前景。
[0003] 近年来由于抗生素的滥用,各种耐药及超级耐药菌层出不穷,对临床的抗感染治 疗造成巨大威胁,因此新型抗病原微生物模板的研发迫在眉睫。Cathelicidins对许多临床 耐药细菌有着很强的杀菌活性,对许多致病菌杀害作用的速度要远远大于传统抗生素的作 用,体外抗微生物测试中,大多数化thelicidin成熟肤可W在微摩尔和亚微摩尔的浓度下 快速杀死广泛的微生物。最重要的是由于其特别的杀菌机制,不会引起耐药性。目前发现 的化thelicidins的杀菌机制有很多,常见的是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的即通 过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面,进一步在细菌细胞膜上形成跨膜 的孔桐,导致细菌细胞内容物的外泄,从而导致细菌细胞的死亡。此外,抗菌肤还具有其他 的杀菌机制,如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制 细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。正是由于作用方式的不同,Cathelicidin 介导的杀菌作用远远快于传统抗生素,并且不会产生耐药性。
[0004] 关于抗菌肤药物,目前cathelicidin的研究热点主要集中在消炎、抗感染和抗真 菌等方面,应用方式可W是局部的也可W是系统的,剂型可W是口服也可W外用。尤其由于 阳离子抗菌肤的表达与皮炎、侵入性烧伤脈血症、肿瘤病毒引起的肉寶等之间的病理联系, 运些抗菌肤对运些疾病的局部治疗有较好的开发前景。目前有部分抗菌肤药物已进入临床 试验阶段,例如Pexiganan是爪赡抗菌肤Magainin的类似物,目前已作为治疗足部感染药 物进入临床试验阶段,它也是第一个进行商业开发的抗菌肤;Η1Π-11是人乳铁蛋白前11 个氨基酸残基组成的抗菌肤,通过I/II期临床试验研究表明Hin-1通过静脉给药时是 安全的、耐受性良好的;来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃瘍,已进入 临床ΙΠ期试验等。化thelicidin的应用不仅限于医药领域,在农业、畜牧业和日化用品领 域,cathelicidin也存在巨大的应用潜能。
[0005] 2002年,世界卫生组织(WHO)发表公告指出"在牲畜养殖过程中,停止W往惯用的 饲料添加剂抗生素的做法,将在不危害动物和农民利益的前提下,可减少对人类健康的威 胁。抗生素作为饲料添加剂应用于动物生产中,对畜牧业的发展起了重要的作用,但是其在 动物体内和动物产品中的残留,W及病原菌产生的抗药性问题,对人类的健康和环境产生 了负面的影响。并且完全使我国出口肉类,海产品等受到了限制,从而影响收益。寻找新型、 安全的抗菌剂代替抗生素,已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。抗菌肤具有广谱 的抗菌作用,对畜禽具有促生长和治疗疾病的功能,是无毒、无害、无残留的绿色产品,有望 成为抗生素的替代品,在畜牧生产上发挥重要的作用。目前在畜禽生产,水产养殖等均有应 有。
[0006]细甸憐蛇(P^honmolurusbivittatus),是蛇亚目憐科憐属印度憐的亚种之一,W体型巨大著称,平均身长至高可达7米,体重可达91公斤,也是世界上最巨型的六种蛇类 之一。细甸憐属于东南亚地区的本±品种,是一种夜行性蛇类,多居于热带森林里,在中国 多见于广东、广西、福建、云南、海南、贵州等地。目前关于细甸憐蛇cathelicidin宿主防御 肤的研究和应用还没有报道。

【发明内容】

[0007] 本发明提供一种在亚微摩尔剂量下即具有很强的抗微生物活性的来源于细甸憐 蛇的一种抗微生物肤,Pb-CATH4及其基因、氨基酸序列和应用。本发明的目的是基于上述 理论研究和现有技术基础,提供一种具有强抗菌活性的细甸憐蛇抗微生物肤化-CATH4及 其应用,着重医药制备,化妆品、保健品、食品和新型饲料添加剂等中的应用。
[000引为了实现本发明的目的,本发明提供了如下技术方案:
[0009]一种源于细甸憐的广谱高效抗微生物肤Pb-CATH4,所述的广谱抗微生物肤Pb-CATH4是一种直链多肤,含有29个氨基酸残基,分子量是3492.llDa,理论等电点(pi) 为12. 54,含有9个碱性氨基酸残基及17个疏水性氨基酸残基。
[0010] 其序列为:苏氨酸-精氨酸-丝氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-精氨酸-苯丙 氨酸-异亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-精 氨酸-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨 酸-亮氨酸-鄉氨酸-甘氨酸。
[0011] 基因测序结果表明编码细甸憐蛇抗菌肤Pb-CATH4前体cathelicidin的基因由 465个核巧酸组成,自5'端至3'端序列为:
[0012]
[0013] 编码细甸憐蛇成熟肤化-CATH4的为376位到462位的核巧酸序列,其编码的氨基 酸序列为:化ri-Arg2-Se;r3-Arg4-T巧 5-Arg6-Arg7-Phe8-Ile9-Arg"-Glyii-Alai2-Gly"-Argi4-P hei5-Alai6-Arg"-ArgiS-Tyri9-Gly2°-Trp2i-Arg22-Ile23-Ala24-Leu25-Gly26_Leu27-Val2S-Gly29。
[0014] 细甸憐蛇抗菌肤Pb-CATH4基因的克隆包括:细甸憐蛇肺总RNA提取,mRNA 纯化,mRNA反转录及cDNA文库构建,设计引物,利用PCR方法筛选细甸憐蛇抗菌 肤Pb-CATH4 基因。5' 端引物分别为Pl(5'-ATGACGGGTGTTTGGGCACTG-3')和P2 巧 ' -GCTGAAGTTCACCATCAAGGAGAC-3'),PCR另一扩增引物为化0NTECH公司Creato/M SMARTTMcDNALibraryConstructionKit中的 3,PCRPrimer引物,其序列为 5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG- 3'。获得阳性单克隆进行基因核巧酸序列测定。
[001引 Pb-CATH4的化学制备方法:根据编码细甸憐蛇cathelicidin抗微生物肤基因推 断的成熟肤化-CATH4氨基酸序列,用自动多肤合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成其 全序列。通过HPLC反相柱层析脱盐纯化,并确定其纯度大于95%。用基质辅助激光解析电 离飞行时间质谱(MLDI-T(F)测定其分子量,等电聚焦电泳测定等电点,用自动氨基酸测 序仪测定氨基酸序列结构。
[0016] 细甸憐蛇抗菌肤Pb-CATH4基因可W作为基因工程制备细甸憐蛇抗菌肤 Pb-CATH4。所述广谱高效抗微生物肤Pb-CATH4,具有极强的广谱抗微生物活性,作为制备 抗病原微生物感染药物或化妆品、保健品、食品、饲料等日化中的添加剂被应用。合成的 Pb-CATH4抗菌肤可W溶于灭菌超纯水,用于药理活性检测。
[0017] 本发明基因克隆得到编码细甸憐蛇cathelicidin抗微生物肤的基因,通过化学 合成方法得到成熟肤化-CATH4。该抗微生物肤富含碱性氨基酸,具有很强的抗菌活性,抗菌 实验显示其对多种临床耐药菌也有较好的杀灭作用。另外,其还具有很低细胞毒性,无溶血 活性,结构简单,不含有二硫键及环状结构,方便化学合成及基因工程制备。
【附图说明】
[0018] 附图是Pb-CATH4对E.coilATCC25922的杀菌动力学图。
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