鱼鳔胶原抗氧化抗疲劳蛋白肽的制作方法

文档序号:9500735阅读:596来源:国知局
鱼鳔胶原抗氧化抗疲劳蛋白肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种从水生生物提取的多肤,尤其设及一种鱼饌胶原抗氧化抗疲劳蛋 白肤。
[0002]
【背景技术】
[0003] 自由基是机体许多生化反应的中间产物,正常情况下,其产生和清除处于平衡状 态。但是,当运一平衡被打破时,自由基会使机体处于氧化压力之下,通过攻击生命大分子 物质及各种细胞器,造成机体在分子、细胞及组织器官水平的各种损伤,加速机体的衰老、 疲劳并诱发各种疾病。
[0004] 根据自由基理论,人体疲劳的产生和体内自由基生成相关,因而具有抗氧化活性 的物质存在潜在的抗疲劳活性。
[0005] 天然的生物活性物质相对于市售的合成剂,具有健康安全的优势,因此,开发海洋 生物活性物质具有重要意义。
[0006] 胶原蛋白主要存在于动物的骨、腫、软骨和皮肤等结缔组织中,是结缔组织中胶原 蛋白纤维的蛋白质。胶原蛋白在发展历史过程中,其重要的材料来源一直是陆生动物猪和 牛,因为它们具有来源丰富的皮和骨。虽然,人们早已了解了鱼胶原蛋白,但遗憾的是,未能 将其作为工业上应用的重要材料,运主要是由于水产捕拱来源不稳定,缺乏规模。近年来, 环境等诸多因素引发了陆生动物疾病的产生,如疯牛病等,陆生动物蛋白质的安全性受到 质疑;而水产养殖和水产品加工业有了很大的发展,鱼皮、鱼鱗、鱼骨和鱼内脏等鱼类加工 下脚料的来源日趋稳定,且具有安全性。因而,对鱼类胶原蛋白的应用与开发已经成为人们 关注的热点。然而,胶原蛋白独特的Ξ螺旋结构是非常稳定的,加热时间短和加热溫度一般 时都难W使其分解,因而不容易被消化吸收。而胶原蛋白水解而得的胶原蛋白肤却能弥补 运一缺陷,其分子量小,易于身体吸收。国内外的研究已经表明,水产胶原蛋白肤具有多种 功能,包括抗氧化、抗疲劳、抑制血管紧张素转化酶、提高免疫力、抗衰老和抗肿瘤等,并且 W其具有的高度生物安全性,可广泛应用于食品、化妆品及医药制备等领域,开发前景非常 广阔。
[0007] 鱼饌作为渔业加工下脚料,常被废弃或作为简单的加工材料而得不到充分的利 用。目前,对于鱼饌蛋白肤的制备及其活性的相关研究甚少,因此,W养殖大黄鱼鱼饌为原 料制备多肤并研究其抗氧化与抗疲劳活性,为海洋药物和保健食品开发提供理论和实验依 据。
[0008]

【发明内容】

[0009] 本发明的目的在于提供一种鱼饌胶原抗氧化抗疲劳蛋白肤,该蛋白肤具有抗氧 化、抗疲劳的特性。
[0010] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:一种鱼饌胶原抗氧化抗疲劳 蛋白肤,该鱼饌胶原抗氧化抗疲劳蛋白肤的氨基酸序列为G1 y-G 1 U-Pr0-G1 y-PrΟ-Met-G ly-Leu-Ala-Gly-Pr〇-Leu-Gly-Pr〇-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pr〇-Asn-His (GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH),其分子量为6719. 5718Da。该蛋白版具有安全无毒副作用 和抗氧化抗疲劳活性强等优点。
[0011]
【附图说明】
[0012] 图1是本发明的蛋白肤分子量测定质谱图; 图2是本发明的蛋白肤高效液相色谱C18柱洗脱峰整体洗脱图; 图3是本发明的蛋白肤高效液相色谱C18柱洗脱峰局部洗脱图。
[0013]
【具体实施方式】
[0014] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0015] 实施例:养殖大黄鱼鱼饌为原料制备多肤并研究其抗氧化与抗疲劳活性,为海洋 药物和保健食品开发提供理论和实验依据。鱼饌胶原蛋白多功能肤的制备方法,其包括W 下步骤: 1)清洗步骤:选取鱼饌用流动水彻底清洗,剪成小块儿(0. 5X0. 5cm。用0. 1Μ化0H W1:10(w/v),每4h更换一次溶剂,然后用冷蒸馈水洗至中性,可除去非胶原蛋白等杂蛋 白;为了脱脂,接着用10%正下醇Wl:l〇 (w/v)的比例浸泡12h,每3h更换一次溶剂,然 后用10倍体积的冷蒸馈水冲洗;在浸泡于85%左右的乙醇中12h,每3h更换一次溶剂, 最后用冷蒸馈水冲洗。将预处理好的鱼饌进行匀浆,备用。
[0016] 2)酶解步骤:W包含动物、植物及微生物蛋白酶在内的4种商业化蛋白酶(木瓜 酶、膜蛋白酶、胃蛋白酶及碱性蛋白酶),分别在其最适条件下酶解匀浆后的鱼饌,酶解时间 均为6h,加酶量均为鱼饌匀浆质量的2%,料液比为1:3 ; 3)纯化步骤:上述步骤处理得到的组分浓缩、冷冻干燥后,通过Se地adexG-25层析 柱(2.6cmX60cm)进一步分离纯化,样品浓度为25111旨/1^,上样量为2血,用去离子水洗脱, 洗脱速度为1. 5mL/min,于紫外分光光度计280nm下检测,收集各洗脱峰,浓缩后冷冻干燥, 检测各洗脱组分的抗氧化活并收集活性较高的洗脱峰进行浓缩,冷冻干燥,W0. 1%TFA去 离子水配制Img/mL样品溶液,过0. 22μm微孔滤膜,利用RP-HPLC进一步分离纯化,色谱 分析条件为:进样量,20yL;色谱柱类型,C18HypersilBDS(250mmX4.6mm,5帕);柱 溫,30°C;流动相为乙腊-水溶液(含有0. 1血/100血的Ξ氣乙酸),采用梯度洗脱,在 50min洗脱时间内乙腊浓度由0%线性递增至100% ;洗脱流速,1.OmL/min;紫外检测波长设 定280nm。同样收集各洗脱峰后,浓缩并冷冻干燥,经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作 为目标肤氨基酸序列为:Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His(GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH)〇
[0017] 自由基是机体许多重要的生化反应的中间代谢产物,正常状况下,其产生和清除 处于动态平衡。然而,自由基是有效的防御系统,如果机体不能维持运一动态平衡,则会 使自己处于氧化压力状态下,自由基通过攻击机体大分子物质和细胞器,对机体造成损伤。 然而,肌肉细胞含有复杂的内源性细胞防御机制W清除氧自由基巧日谷脫甘肤过氧化物酶 (GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氨酶(CAT)等),对机体由运动引发的氧化损伤和 DNA损伤具有一定的保护作用。GSH-Px可加速&〇2和G甜的反应,并将它们转化为水和氧 化性谷脫甘肤;SOD可W清除超氧阴离子自由基;CAT可W降解径自由基。
[001引 表1本发明蛋白肤(SBP-III-3)对小鼠负重游泳时间的影响_
注:与对照组比较冲<0. 05, *冲<0. 01 ;与低剂量组比较平<0. 05,bp<0. 01 评价剧烈运动能力的又一重要指标是能量W糖原形式储存的能力。运动所需能量首先 来源于糖原的分解,然后来自肌肉和肝脏中的糖原流通。运动中,当肌糖原减少时,肝糖原 含量的降低则成为运动耐力的主要限制因素。因此,增加肝糖原和肌糖原储备有利于增强 耐力和运动能力。各剂量组小鼠的肝糖原水平明显高于对照组,并且高剂量组显著高于低 剂量组(P<0. 05或P< 0. 01)。剂量组SBP-HG和SBP-MG小鼠的肌糖原水平明显高于对照 组(P< 0.01)。此结果表明,纯化肤可通过维持体内糖原含量为机体储备能量而达到抗疲 劳的效果。
[0019] 表2本发明蛋白肤(SBP-III-3)对小鼠抗氧化酶活力的影响
注:与对照组相比*尸< 0. 05,**Κ0. 01 ;与低剂量组相比a尸< 0. 05,V< 0. 01 实验通过测定SOD、GSH-Px和CAT的活性W评价纯化肤SBP-III-3的抗氧化活性。结 果如表2所示与对照组相比,剂量组SBP-HG和SBP-MG小鼠体内的T-S0D活性分别增加了 44. 2%和15. 7%,具有差异显著性,然而低剂量组SBP-LG则增加了 4. 2%,与对照组并无显 著性差异(P< 0.05)。另外,剂量组SBP-HG和SBP-MG之间也有显著差异性(P< 0.01)。 GSH-Px和CAT的活性与T-S0D具有相同趋势。丙二醒(MDA)是一种脂质过氧化物,可W反 映机体自由基的含量。本实验还检测了小鼠肝脏和血浆中的MDA含量。结果如表3所示, Ξ个剂量组小鼠的MDA水平均低于对照组水平,且高、中剂量组小鼠的肝脏中MDA含量均显 著高于对照组(P< 0.05或P< 0.01)。W上研究结果表明,该纯化肤可能通过控制自由 基的积累W保护机体不受氧化损伤,从而具有抗疲劳的效果。
[0020] 表3本发明蛋白肤(SBP-III-3)对小鼠血浆和肝脏中MDA含量的影响
注:与对照组相比*/^ < 0. 05,**Κ0. 01 ;与低剂量组SBP-LG相比节< 0. 05,V< 0. 01 尽管已结合优选的实施例描述了本发明,然其并非用W限定本发明,任何本领域技术 人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,能够对在运里列出的主题实施各种改变、同 等物的置换和修改,因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1. 一种鱼鳔胶原抗氧化抗疲劳蛋白肽,其特征该鱼鳔胶原抗氧化抗疲劳蛋白肽的氨基 酸序列为: Gly-Glu-Pr〇-Gly-Pr〇-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pr〇-Leu-Gly-Pr〇-Ala-Gly-Gly-Ser-T yr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His,其分子量为6719. 5718Da〇
【专利摘要】本发明涉及一种鱼鳔胶原抗氧化抗疲劳蛋白肽,该鱼鳔胶原抗氧化抗疲劳蛋白肽的氨基酸序列为:Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His,其分子量为6719.5718Da。该蛋白肽具有安全无毒副作用和抗氧化抗疲劳活性强等优点。
【IPC分类】A61P39/00, A61K38/17, A61P39/06, C07K14/46
【公开号】CN105254737
【申请号】CN201510758952
【发明人】丁国芳, 曾丽, 徐银峰, 贾盈露, 余方苗, 陈锐
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月10日
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