及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学及基因工程领域，具体地说，涉及一种马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法。
【背景技术】
[0002]埃博拉出血热由埃博拉病毒(Ebola virus, EB0V)引起，病死率可高达90%，是当今世界最恐怖烈性的传染病。本病自1976年于非洲埃博拉河流域发现以来，每年都有发生，今年的疫情尤为严重，自2014年3月以来，于非洲几内亚、利比里亚、塞拉利昂持续暴发，快速蔓延，疫情几近失控，截止2014年10月9日已确诊3750人，死亡1876人，WHO呼吁世界加强防控。
[0003]我国处于WHO公布的埃博拉自然疫区范围内，在我国南方地区存在埃博拉病毒的自然宿主，锤头果蝠、富氏前肩头果蝠和小项圈果蝠。中国科学院武汉病毒研究所的研究人员对我国部分地区的蝙蝠进行血清学检测，发现有莱斯顿型埃博拉病毒(EB0V-R)流行的血清学证据；也有报道称我国猪体内EB0V-R病原核酸呈阳性，但是尚未发现致死性埃博拉病毒病病例。需要特别提及的是，我国的邻国菲律宾2009年曾2次发生EB0V-R疫情。目前我国在40多个非洲国家派有医疗队、维和部队和维和警察队等援外人员达2万余人。随着国际交往日益增多，该病传入我国的可能性加大。同时，国际国内政治斗争形势日趋复杂化，作为被列入禁止生物武器公约名单的埃博拉病毒也有可能被恐怖分子和敌对势力所利用，危害我国公共卫生安全。目前该病尚无有效预防和救治药物。
[0004]抗血清用于抗病毒治疗已有100多年的历史，1988年英国微生物实验室工作人员感染埃博拉病毒后使用抗血清治疗痊愈；特别是，近期美国赴西非2名医务人员感染埃博拉病毒后利用抗体治疗也证明有效。抗血清的优点是特异性强、效价高、作用快、制备周期短，生产量大。我国也早已批准人用马抗狂犬病血清、破伤风抗毒素血清、抗蛇毒血清等异源抗体制剂。因此，精制马抗的研制和应急储备对日趋严峻的埃博拉疫情防控十分必要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高效、安全、可靠的马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明提供一种制备马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2的方法，其是将同时表达扎伊尔型埃博拉病毒的GP和VP40两个基因(GenBankAccess1n N0.AY354458，Zaire 1995)的病毒样颗粒经灭活、纯化与免疫佐剂混合作为免疫原，通过多次免疫健康马匹，获得高免血浆，分离纯化IgG蛋白，然后IgG蛋白经胃蛋白酶酶切，酶切产物经DEAE离子交换层析柱，收集洗脱液，脱盐、冻干，即得马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2。
[0007]所述制备方法具体包括以下步骤:
[0008]1)将扎伊尔型埃博拉病毒的两个基因GP和VP40克隆于同一昆虫细胞高效表达载体上，转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获上清，即得到同时表达扎伊尔型埃博拉病毒的GP和VP40两个基因的病毒样颗粒；
[0009]2)将上述病毒样颗粒经纯化后与弗氏不完全佐剂混合，健康马匹经过背部皮下分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，检测马血浆效价达到1:5000以上时采血；采用饱和硫酸铵沉淀法，从血浆中分离纯化IgG蛋白，然后用胃蛋白酶进行酶切，酶切产物过DEAE离子交换层析柱，收集穿透峰、洗脱峰，最后过G-25脱盐凝胶柱，收集蛋白峰，过滤、冻干，即得马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2。
[0010]前述的方法，步骤1)中所述昆虫细胞高效表达载体选自ACRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZ1、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUffl、pAcUW2U pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW3U pAcUW4U pAcUW42、pAcUW43、pAcUW5UpAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacII1、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP1、pJVrsMAG、pMBac、pP1、pPAKl、pPBac、pSHONEXl.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV V1-、pVL1391、pVL1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHTB、pFastBacHT C、pFastBacDual。优选 pFastBacDual。
[0011]步骤1)中使用的昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf21、Sf9、Mimic Sf9 细胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)Se 301 细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)BT1-Tn-5B1_4 细胞系、BT1-Tn-5C1 细胞系、BT1-Tn-5F2 细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura) ZSU-S1-1 细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢细胞系BmN。优选Sf9。
[0012]步骤1)中所述扎伊尔型埃博拉病毒的两个基因GP和VP40可根据昆虫细胞偏爱密码子进行基因优化，然后将优化后的基因GP和VP40克隆于同一昆虫细胞高效表达载体上。
[0013]步骤2)中病毒样颗粒经蔗糖密度梯度离心(用20%、30%、60%蔗糖密度梯度离心)后，在30%和60%之间得到纯化病毒样颗粒后，与弗氏完全佐剂按1:2的体积比混合。
[0014]步骤2)中所述饱和硫酸铵沉淀法具体为:取马血浆适量，在搅拌下加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为31 %，然后在20°C，8000rpm离心30min，弃上清，取沉淀。
[0015]步骤2)中采用胃蛋白酶酶切的具体方法为:向纯化的IgG蛋白中加入胃蛋白酶(胃蛋白酶的终浓度为7-10U/mL)，混匀，于30°C消化3.5-4.5h。酶解完成后用5mol/L NaOH调溶液pH值至5.2，终止酶解反应。置于57°C保持30min，待温度降至45°C以下后离心，上清为F(ab' )2粗品。
[0016]步骤2)中使用的DEAE离子层柱中填料为DEAE_Sepharose FF。过DEAE离子交换层析柱时使用的洗脱缓冲液成分为:含有0.5M Tris-HCl和1.0M NaCl的pH8.5的溶液。
[0017]本发明还提供按照上述方法制备的马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2。
[0018]本发明还提供所述马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒病药物中的应用。
[0019]本发明进一步提供由所述马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)^lj备的用于预防和/或治疗埃博拉病毒病的药物。
[0020]本发明制备的马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2含量不低于总蛋白含量的95.0%。本发明产品为冻干粉剂型，具有高效价的中和埃博拉病毒特性，可作为治疗埃博拉病毒病人的一种新的有效药物，用于埃博拉病毒感染患者的紧急救治。
[0021]本发明提供的马抗埃博拉病毒特异免疫球蛋白F(ab’)2，是用于预防和治疗埃博拉病毒所引起的埃博拉病毒出血热的有效药物，对埃博拉病毒感染重症患者具有显著疗效，提高患者的存活率。本品将填补国内此类药物的空白。本发明的制备工艺采用独特的工艺参数控制，用常规的分离法生产出所述特异性免疫球蛋白，适于工业化生产，产品安全可靠。用于制备马抗埃博拉病毒特异免疫球蛋白F(ab’)2的原料血浆有稳定高效的来源，能满足血浆的供给。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0023]实施例1马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
[0024]马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2的制备方法包括以下步骤:
[0025]1、免疫原的制备:将扎伊尔型埃博拉病毒的两个基因GP和VP40(GenBankAccess1n N0.AY354458, Zaire 1995)克隆于同一昆虫杆状病毒表达载体 pFastBacDual上，转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞Sf9，拯救获得重组杆状病毒，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞Sf9，27°C静止培养48-72h后收获细胞上清液，即得到同时表达扎伊尔型埃博拉病毒的GP和VP40两个基因的病毒样颗粒。
[0026]经鉴定，达到要求表达量的病毒样颗粒，采用蔗糖密度梯度离心((用20%、30%、60%蔗糖密度梯度离心)后，在30%和60%之间得到纯化病毒样颗粒。
[0027]2、将上述病毒样颗粒灭活液与弗氏完全佐剂按1 '2的体积比混合均匀，挑选健康马匹(优选4-6岁体质