大气细粒子微生物的原位培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域中大气细粒子微生物的原位培养方法。
【背景技术】
[0002]当前我国环境问题较为突出，环境污染已经威胁到人类健康，特别是大气污染问题日趋严重，霾锁连城事件频发。雾霾中的大气细粒子(PM)粒径较小(< ΙΟμπι)，可以被人体吸入，沉积在呼吸道、肺泡等部位从而引发疾病。颗粒物的直径越小，进入呼吸道的部位越深。ΙΟμπι直径的颗粒物通常沉积在上呼吸道，5 μπι直径的可进入呼吸道的深部，2 ym以下的可100%深入到细支气管和肺泡。根据其空气动力学直径(d)可以将大气细粒子分为 3 类:粗颗粒物(course particle，d〈10um, PM1Q)、细颗粒物(fine particle，d<2.5 μ m, PM2 5)、超细颗粒物(ultrafine particle, UFPs, d〈0.1 μ m, PMai)。随着大气细粒子的物理和化学特性研究的趋于成熟，大气细粒子中的微生物成分受到更多的关注。
[0003]滤膜式大气细粒子采样器由其高采样效率、高样本量、多粒径采集性及更小粒径可采集性等优点，得到广泛的应用。通过更换不同的采样切割头可以采集得到不同粒径的大气细粒子，如PM1(^P PM2.5。然而，通过上述采样方法得到的大气细粒子附着在大气采样滤膜上，利用传统培养方法(如涂布法)对其进行微生物培养实验步骤繁琐，操作复杂。目前尚没有有效便捷的培养方法，用于进行使用滤膜式大气细粒子采样器采集得到的大气细粒子中微生物可培养性研究。
[0004]大气细粒子中微生物可培养性的研究多采用直接将大气细粒子采集到培养基上或溶液内的方法进行培养，这种方法无法将不同粒径的大气细粒子中的微生物分别进行培养，或同一样品只能用于单一培养实验。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是如何原位培养大气细粒子微生物。
[0006]为解决上述技术问题，本发明首先提供了大气细粒子微生物的原位培养方法。
[0007]本发明所提供的大气细粒子微生物的原位培养方法，包括下述1)-3):
[0008]1)用滤膜采集大气细粒子，得到含有大气细粒子的滤膜；
[0009]2)将所述含有大气细粒子的滤膜平铺在无菌LB固体培养基上，得到接种有大气细粒子微生物的培养基；
[0010]3)将所述接种有大气细粒子微生物的培养基在无菌条件下进行培养，得到原位培养的大气细粒子微生物。
[0011]上述方法中，所述采样滤膜为石英滤膜。所述石英滤膜具体可为Munktell公司产品，产品目录号为420065。所述石英滤膜为无菌石英滤膜。所述无菌石英滤膜可在500-600°C下煅烧5-6小时得到。
[0012]上述方法中，所述大气细粒子可为空气当量学直径< 10 μπι的大气颗粒物。
[0013]上述方法中，所述将所述含有大气细粒子的滤膜平铺在LB固体培养基上可为将所述含有大气细粒子的滤膜的采样面平铺在LB固体培养基上。
[0014]上述方法中，所述培养可在恒温培养箱中进行。
[0015]上述方法中，所述培养的温度可为37 °C。
[0016]上述方法中，所述培养的时间可为48小时。
[0017]实验证明，利用本发明的大气细粒子微生物的原位培养方法，可以培养出不同的单菌落，菌落较多，且该方法操作简单、快捷，PM2.5菌落数可达44个菌落，PM i。菌落数可达98个菌落；实验中采样后的采样滤膜可以多次利用进而可以对同一批大气细粒子微生物进行多次培养。而利用大气细粒子微生物的涂布培养方法，将与大气细粒子微生物的原位培养方法相同条件下得到的含有PM2.5和PM i。的大气采样滤膜的菌落数分别为10个和14个，该方法操作复杂，得到的菌落数少，分别为大气细粒子微生物的原位培养方法的22.7%和14.3%。实验证明，本发明的大气细粒子微生物的原位培养方法可以用来原位培养大气细粒子微生物，并用于大气细粒子可培养微生物的研究。
【附图说明】
[0018]图1为采集大气细粒子的石英滤膜。左图(图C)为采集大气细粒子PM2.5的石英滤膜，中图(图A)为采集大气细粒子PM1Q的石英滤膜，右图(Blank)为空白对照。
[0019]图2为含有大气细粒子的滤膜平铺在无菌LB固体培养基上的图片。
[0020]图3为接种后的LB培养基。左图(图A)为接种有PM2.5的LB培养基，右图(图B)为空白对照。
[0021]图4为利用大气细粒子微生物的原位培养方法得到的生长有菌落的培养基。C和A均为利用大气细粒子微生物的原位培养方法得到的生长有菌落的培养基，C为PM1(]，A图为PM2.5，B为空白对照。
[0022]图5为大气细粒子微生物的涂布培养方法得到的生长有菌落的培养基。左图(图c)为PM1(^^涂布培养方法得到的生长有菌落的培养基，右图(图a)为PM 2.5的涂布培养方法得到的生长有菌落的培养基。
【具体实施方式】
[0023]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0024]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]下述实施例中采集的大气细粒子为PM2.5(空气动力学当量直径小于等于2.5 μ m) ο
[0027]下述实施例中的石英滤膜为Mulktell公司产品，产品目录号为420065。石英滤膜需在采集大气细粒子前，在马弗炉中煅烧，得到无菌的石英滤膜；煅烧条件为500-600°C;煅烧时间为5_6小时。
[0028]实施例1、大气细粒子微生物的原位培养
[0029]大气细粒子微生物的原位培养方法，包括下述1)-3):
[0030]1)用大气采样石英滤膜采集大气细粒子，得到含有大气细粒子的采样滤膜；
[0031]2)将含有大气细粒子的采样滤膜平铺在无菌LB固体培养基上，得到接种有大气细粒子微生物的培养基；
[0032]3)将接种有大气细粒子微生物的培养基在无菌条件下进行培养，得到原位培养的大气细粒子微生物。
[0033]实验重复三次，每次重复实验的设置三个平行实验，具体操作步骤如下:
[0034]1、用带有无菌大气采样滤膜(石英滤膜)的崂应2034型空气重金属采样仪将PM2.5颗粒物采集于大气采样滤膜上，采样时间为23h，得到含有PM2.5的大气采样滤膜(图1);
[0035]2、配制无菌LB固体培养基；