一种自生固氮菌mbc5及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物固氮领域，具体涉及一种自生固氮菌MBC5及其应用。
【背景技术】
[0002]荒漠生态系统占全球面积的41 % (Delgado-Baquerizo, et al.，2013)，其净初级生产力约占陆地生态系统生产力的20% (Whittaker，1975)。在荒漠生态系统当中，土壤氮素养分的匮乏严重地限制了系统净初级生产力(Asner，et al.，2003，Crutsinger，et al.,2013，Reich，et al., 2006) 0而且荒漠化还在进一步发展，导致了土地退化，氮素养分流失严重。
[0003]自然环境中的氮素输入方式主要为生物固氮。固氮作用增加土壤可利用氮含量，为微生物和植物补充氮素促进其生长和代谢，以增加生态系统的初级生产力，并且对于生态系统的氮素循环也有着至关重要的作用。生物固氮主要有共生固氮和自生固氮。由于荒漠地区环境条件恶劣，植被稀少，因此可以进行共生固氮的豆科植物也十分稀少，自生固氮是荒漠生态系统主要的氮素输入方式。因此，自生固氮对于荒漠化防治工作和荒漠生态系统的恢复有重大意义。
[0004]为了帮助荒漠化防治工作，对于荒漠土壤自生固氮菌的研究和应用迫在眉睫。目前对于固氮细菌的报道仍以共生固氮菌为主，对于自生固氮菌的报道非常少。而且这些少量已知的自生固氮菌剂对环境温度和湿度等环境条件均有要求，抗逆性较差，多应用于农田或者堆肥当中，不适于环境条件恶劣的荒漠生态系统。
[0005]因此有必要提供一种抗逆性强、适用于荒漠生态系统的具有自生固氮能力的固氮菌株。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种适用于干旱、温差大、盐碱灾害和高紫外线强度并且可以自生固氮的菌株，以增加土壤固氮活性和有效氮含量。
[0007]为达到以上目的，本发明提供了一种自生固氮菌(Massilia albidiflava)MBC5，其保藏号为CGMCC N0.10821，保藏日期为2015年5月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0008]上述菌株为Massilia albidiflava。菌株 Massilia albidiflava(菌种名)-MBC5(菌株名)，是将荒漠地区的表层土壤用无菌装置采集低温条件在带回实验室，经过分离、纯培养，革兰氏染色、固氮活性检测和16srDNA测序所得。
[0009]形态特性:该菌株在格兰仕染色切片上观察看到细胞呈单个，直的杆菌，不是螺旋状。无鞭毛，不产生鞘或凸起物，没有休止阶段，不形成芽胞，无荚膜，格兰仕阴性。
[0010]培养特性:该菌株在阿须贝培养基上于28°C -30°C培养48h后，生长良好，专性需氧。菌落形态各异，多数直径1cm，圆形、凸起、边缘不整齐。
[0011]生理特性:NaCl (50g/L, 30°C )生长实验样性，吡咯烷基方胺酶实验样性、半定量触酶实验样性，氧化酶阴性，吲哚阴性，拉丝试验阴性，硝酸盐还原阴性，脲酶阴性。
[0012]功能特性:通过斜面阿须贝培养基培养，用乙炔还原法测定，该菌株表现出了固氮活性。
[0013]本发明还提供了含有所述自生固氮菌MBC5的菌剂。所述菌剂可以为液体菌剂，也可以为固体菌剂。
[0014]可选的，所述菌剂中还含有菌体吸附材料，所述菌体吸附材料选自草炭、珍珠岩、蛭石粉和微粉碳酸钙中的至少一种。
[0015]可选的，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC5的含量为2.1 X 10s_2.9X 10scfu/g。
[0016]优选的，在所述菌剂中，自生固氮菌MBC5的含量为2.9X10scfu/g。
[0017]可选的，所述菌剂的pH值为6.8-7.2。
[0018]本发明还提供了所述菌剂的制备方法，包括以下步骤:
[0019]将所述自生固氮菌MBC5接种于一级斜面培养基中，在28-30°C培养3_5天，获得一级菌株；将所述一级菌株接种于二级液体培养基中，在28-30°C条件下震荡培养2-3天，获得二级菌株；将所述二级菌株接种于三级固体培养基中，在28-30°C条件下培养在1-2天后获得三级菌株；将所述三级菌株与草炭按照(2.1 X 108-2.9X 108) cfu/g的配比混匀匀后获得菌剂，优选为2.9X 10scfu/g ;
[0020]其中，所述一级斜面培养基的配方为:KH2P040.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg，pH 7.0，琼脂 20g，蒸馏水 lOOOmL ；
[0021 ] 二级液体培养基的配方为:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC035.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，蒸馏水 lOOOmL ；
[0022]三级固体培养基的配方为:甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgS04.7H20 0.2g，K2HP04
0.5g，NaCl 0.lg, CaCl2 0.05g，Rh 微量元素液 4.0mL，H20 1000mL，琼脂 20g，pH 6.8-7.0。
[0023]本发明还提供了所述自生固氮菌MBC5或所述的自生固氮菌剂在土壤改良中的应用。
[0024]可选的，所述应用包括将所述菌剂和砂土按质量比1:9-11混合均匀后施用于土壤表面。
[0025]可选的，所述菌剂的用量为420_560g菌剂/亩。
[0026]发明提供了一种自生固氮细菌，通过乙炔还原法直接测得其固氮活性为8.1nmol/yL-ho该菌株是从宁夏地区的荒漠生态系统环境提取的。该地区气候干旱；全年以及昼夜温差大(冯薇，2014) ; 土壤盐碱灾害严重，紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到2(K)-533 μW/Cm2(蒲爱萍，et al.，2005)，辐射指数在8级左右。而一般情况下在辐射强度在70-130 μ W/cm2的紫外线下，辐射时间从15s到30min不等，杀菌率可达99%以上(李香云，et al., 2006,张凤才and袁而森，1988，张福云and况凡，2005)。普通灭菌条件的紫外线强度和照射时均明显低于宁夏夏季的紫外线强度。该菌株在干旱、大温差、盐碱灾害和强烈的紫外线辐射下依然能够生存繁殖并具有固氮活性，尤其该细菌对紫外线的高度抗性是一般细菌所不具备的，在全球气候变化臭氧空洞增加紫外线辐射日益强烈的今天来说，更加具有生态学意义和广阔的应用价值。其制成的菌剂能够施用于干旱、高紫外线辐射的生态系统，并且能够增加这些生态系统的氮素积累，可以起到改良土壤环境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加净初级生产力。实验表明，将该菌剂接种在宁夏西南缘无固氮活性的裸沙表面一年之后，其表层可以检测到固氮活性，为10.58n mol C2H2m 2h \并且有效氮也增加了由3.16mg kg1增加到了 8.9mg kg \简单说，该菌株制成的菌剂有制作简单、低成本、抗干旱、高紫外线抗性和固氮等优点。
[0027]保藏信息:保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ChinaGeneral Microb1logical Culture Collect1n Center(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101);保藏日期是2015年05月19日；该保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.10821 ;该保藏中心建议的分类命名是Massiliaalbidiflava ;菌株编号为 MBC5。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029]实施例1
[0030]该菌株是从宁夏地区的荒漠生态系统表层提取的。该地区气候干旱；全年和昼夜温差大(冯薇，2014);紫外线非常强烈，尤其夏季紫外线强度高达到200-533 yW/Cm2(蒲爱萍，et al.，2005)，辐射指数在8级左右。而一般情况下在辐射强度在70-130 μ W/cm2的紫外线下，福射时间从15s到30min不等，杀菌率可达99%以上(李香云，et al., 2006,张凤才and袁而森，1988，张福云and况凡，2005)。普通灭菌条件的紫外线强度和照射时均明显低于宁夏夏季野外的紫外线强度，因而该菌株具有对紫外线具有高度抗性。
[0031]称取表层土壤样品10g并放入带有玻璃珠的100mL的无菌水中静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成土壤悬液。用无菌移液管分别吸取5.0mL上述土壤悬液加入45mL无菌水中稀释，用无菌移液管将菌悬液加至固体阿须贝培养基上，于28°C的条件下培养。以平板划线法纯化菌株。本发明所用的阿须贝培养基的配方为:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，琼脂 20g，蒸馏水 1