尸毒梭菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明是关于一经分离的尸毒梭菌（Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005及 其应用，尤其关于该尸毒梭菌菌株ITRI04005于进行发酵反应W生产有机化合物的应用， W及该尸毒梭菌菌株ITRI04005于基因改造的应用，包括：提供一可W表现或增强表现产 醇路径酵素的基因的基因改造菌株、提供一减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基 因的基因改造菌株、W及提供一可W表现或增强表现热休克蛋白化eatshockprotein， HS巧的基因的基因改造菌株。
【背景技术】
[0002] W往关于梭菌属（Clostridiumsp.)细菌的研究，大多是集中在致病菌株的探 讨。然而，近年来随着生质燃料化io化el)的发展，有些适用于生产生质燃料的梭菌也逐 渐受到重视，例如热纤梭菌（Clostridiumthermocellum)具有强效的纤维素水解酶，其 可直接利用纤维素产生乙醇与氨气。此可参见例如：化eier等人的文献（ApplEnviron Microbiol. 1988Jan;54(1) :204-211)，该文献全文并于此处W供参考。又例如，将达梭菌 (Clostridium,ljungd址lii)，其可W气体（例如一氧化碳或二氧化碳等碳氧化物加氨气） 作为原料而产生乙醇。
[0003] 尽管已有许多可用于生质燃料或化学品生产的菌株，但该等菌株一般是W发酵 培养基中的醋类作为碳源，并W发酵培养基中的蛋白腺（peptone)作为氮源，在碳源及氮 源缺一不可的情况下生产有机化合物，甚少菌株是可W利用不同类型的物质做为基质。此 夕F，微生物经由发酵反应W代谢基质所产生的代谢产物通常为成分复杂的混合物，必须通 过纯化分离程序W取得所欲的标的代谢物。例如，梭菌属（ClostridiumSP.)细菌通过丙 酬-下醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，AB巧发酵程序会产生下醇、乙醇、及丙酬，并 伴随少部分的有机酸（例如乙酸、下酸）。另，微生物对于代谢产物的耐受性也是影响发酵 反应的产率的重要因素。因此，业界仍需要可利用不同类型的基质且同时提供良好的目标 产物产率的微生物，故致力于研究与开发可利用多元料源W生产化学品或生质燃料且具有 局广物耐雙性的菌株。
[0004] 本发明即为针对上述需求所作的研究，本案发明人筛选得到一新颖的尸毒梭菌 (Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005,此菌株除可利用醋类及/或胺基酸作为基质W 生产有机化合物，其相较于其他已知的梭菌菌株更适合用于基因改造操作，W提供可利用 醋类及/或胺基酸作为基质生产有机酸或醇、具有高产物专一性、及/或具有高产物耐受 性的基因改造菌株，所获得的基因改造菌株可应用于利用多元料源W生产化学品或生质燃 料，并提供良好的目标产物产率。
【发明内容】
[0005] 本发明的一目的，在于提供一种经分离的尸毒梭菌（Clostridiumcadaveris)菌 株口RI04005,其寄存于德国国家菌种保藏中屯、值SMZ)，寄存编号为DSM32078。该尸毒梭 菌菌株口RI04005具有如SEQIDNO: 1所示的16S核糖体核糖核酸（16SrRNA)片段，或具 有与SEQIDNO: 1具至少95%相似度的16S核糖体核糖核酸（16SrRNA)片段。
[0006] 本发明的另一目的，在于提供一种基因改造菌株，其是由尸毒梭菌菌株ITRI04005 经基因改造而得。较佳地，该基因改造菌株具有如SEQIDNO: 1所示的16S核糖体核糖核 酸（16SrRNA)片段，或具有与SEQIDN0:1具至少95%相似度的16S核糖体核糖核酸（16S rRNA)片段。较佳地，该基因改造菌株符合W下的至少一条：
[0007] (1)可W表现或增强表现产醇路径酵素的基因；
[0008] 似减弱表现或不会表现参与乙酸合成的酵素的基因拟及
[0009] (3)可W表现或增强表现热休克蛋白化eatshockprotein,服巧的基因。
[0010] 本发明的又一目的，在于提供一种生产有机酸的方法，其包含提供一基质，W及使 上述的尸毒梭菌菌株ITRI04005及/或上述的基因改造菌株于厌氧氛围下利用该基质进行 发酵反应W产生有机酸。
[0011] 本发明的再一目的，在于提供一种生产醇的方法，其包含提供一基质，W及使上述 的基因改造菌株于厌氧氛围下利用该基质进行发酵反应W产生醇。其中，该基因改造菌株 可W表现或增强表现产醇路径酵素的基因。
[0012] 本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于W下内容中，W供本发明 所属领域技术人员据W明了本发明的特征。
【附图说明】
[0013]图1是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株ITRI04005W及尸毒梭菌模式菌株 (typestrain)BCRC14511培养于一葡萄糖浓度为5克/升的CGM培养基中，并于不同时间 点所测得的ODe。。数值的曲线图；
[0014] 图2A及图2B是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株ITRI04005W及尸毒梭 菌模式菌株BCRC14511培养于一培养基，进行发酵反应后，所测得的下酸碳转化率的长条 图，其中，图2A的培养基是一葡萄糖浓度为5克/升的CGM培养基，图2B的培养基是一葡 萄糖浓度为3克/升且乳酸盐浓度为2克/升的CGM培养基；
[0015] 图3所示为带有酒精去氨酶（alcoholdehy化ogenase，a化）基因的pGE536重组 质体；
[0016] 图4所示为「pta-ack」基因片段经「catP」基因片段取代的PGE403转殖质体；
[0017] 图5A及图5B所示分别为带有hspl8基因的PGE406重组质体W及带有「groE化」 基因的PGE407重组质体；
[0018] 图6是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株ITRI04005、ITRI05023、W及 ITRI05025分别培养于一下酸钢浓度为10克/升的CGM培养基中、或一不添加下酸钢的CGM 培养基中，进行发酵反应后，所测得的相对下酸生成率的长条图；
[0019] 图7A及图7B是显示，于一厌氧氛围下，将尸毒梭菌菌株口RI04005W及 ITRI05023培养于不同下酸钢浓度的CGM培养基中，并于不同时间点所测得的ODe。。数值的 曲线图，其中，图7A的下酸钢浓度为10克/升，图7B的下酸钢浓度为15克/升。
【具体实施方式】
[0020] W下将描述根据本发明的部分具体实施态样；只是，在不背离本发明精神下，本 发明尚可W多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述 的。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中（尤其是在权利要求书中）所使用的「一」、 「该」及类似用语应理解为包含单数及复数形式。另，本文所使用的「约」、「大约」或「近乎」 等词，实质上代表与所述的数值相差在20%W内，较佳在10%W内，且更佳在5 %W内。
[0021] 此外，于本发明中，所谓的「微生物」是指肉眼无法看见的生物体（例如：细菌、 真菌），其可包括于自然界中自然存在的野生型（wildtype),W及因任何因素（天然或人 为）所产生的突变型（mutant)。所谓「发酵反应」是指微生物代谢一或多种物质W产生 有机化合物的过程。所谓「培养基」是指可提供微生物菌株生长、繁殖所需的养分与条件 (如酸碱值、湿度等）的必要成分物质，通常是视所欲培养的微生物菌株而调整组成，例如 可添加氯化氨、氨氧化钢、氨氧化锭（畑4〇巧、硫酸锭（(NH4)2S04)、氯化锭（NH4CI)、乙酸锭、 酸氨二钟（K2HPO4)、憐酸二氨钟（KH2PO4)憐酸二氨钢（NaHzPOs)、憐酸氨二钢（NazHPOs)、巧 樣酸（citricacid)、含水硫酸儀（M拆〇4· 7&0)、含水硫酸铁（FeS〇4· 7&0)、含水硫酸儘 (MnS〇4· 7&0)，W调整原料至一所欲的抑值（例如：p册.5、P册），或调整其他物理、化学或 生理性质。所谓「基质（substrate)」，是指能够在微生物发酵反应中作为原料，进入发酵反 应的代谢路径而被转化为有机化合物的，本发明是使用含有例如醋类、胺基酸、或其组合的 基质。
[0022] 另，除非另外单独限定，否则于本说明书中所述的化学名称即指该化学名 称的所有异构型式，举例来说，但不限于，镜像异构物（enantiomer)、非镜像异构物 (diastereomer)及构形异构物（conformationalisomer)。举例来说，「乳酸」、「葡萄糖」、 「木糖」、「半乳糖」等词即同时包括D型值化rm)及L型化化rm)异构物。当该醋类可同 时存在开环及环状型式时，其椅型（chair化rm)的构形异构物及α、β异构物均包括在 内。
[0023] 于本说明书中，所谓「碳转化率」是指在发酵反应中，所生成的有机化合物的总碳 数与所消耗碳源的总碳数的比值，W如下式1进行计算。
[0024]式 1 :
[00巧]本案发明人自±壤样本中筛选出一种新颖的梭菌，经16S核糖体核糖核酸（16S rRNA)序列分析，依亲缘关系鉴定为Clostridiumcadave;ris(中文名称为尸毒梭菌），且经 命名为ClostridiumcadaverisITRI04005(W下称为尸毒梭菌菌株ITRI04005)，其寄存于 德国国家菌种保藏中屯、值SMZ)，寄存编号为DSM32078。尸毒梭菌菌株口RI04005具有如 SEQIDN0:1所示的16S核糖体核糖核酸（16SrRNA)片段，或具有与SEQIDN0:1具至少 95%相似度的16S核糖体核糖核酸（16SrRNA)片段。
[0026] 经发现，本发明尸毒梭菌菌株ITRI04005相较于其他已知的梭菌菌株更适合用于 基因改造操作。因此，本发明亦关于一种基因改造菌株，其是由尸毒梭菌菌株ITRI04005经 基因改造而得。
[0027] 于本发明中，所谓「基因改造」是指利用现代分子生物技术，W人为的方法修饰或 改变一物种（例如：动物、植物、微生物、病毒）的遗传物质。可用于基因改造的手段包括， 但不限于，基因剔除（knock-out