一种高效分泌表达克氏原螯虾钙调蛋白基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种高效分泌表达克氏原馨邮巧调蛋白（CaM)基因的方法，属于生物 工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 如何实现无/弱副作用的人工卵巢发育调控一直是经济邮蟹养殖的重要难题之 一。目前人们虽已摸索出不少促邮蟹卵巢快速成熟方法，如控溫、控光、强化营养条件、激 素处理等，但眼柄切除仍是不少邮蟹人工育苗生产中促进亲邮卵巢快速成熟及产卵的最常 用、最有效方法。目前在邮蟹繁殖季节，人工切除雌性邮蟹的单侧眼柄用W促进卵巢同步发 育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少国家较为普遍应用于多种海洋和淡水经济邮蟹（如斑 节对邮、大西洋龙邮、银缘青蟹等）的规模化养殖中。然而，应用实践中会出现无法避免的 副作用：切除眼柄后易致亲体蚁皮周期缩短、死亡率上升、卵子质量下降等不良后果，原因 可能是眼柄组织除分泌GIH外，还分泌其它若干重要激素（如蚁皮抑制激素MIH、高血糖激 素CHH)，眼柄切除后同时也影响了该些激素的体内丰度水平，从而导致了邮蟹不良作用的 发生。眼柄切除诱导邮蟹类卵巢快速发育成熟（简称卵巢"眼柄切除效应"）存在相似的分 子机制，深入阐明该分子机制将非常有助于发掘到新的、更合理的人工生殖调控分子祀点， 从而指导发展可替代眼柄切除、无/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，对于经济邮蟹 类人工养殖业的发展具有重要价值。
[0003] 克氏原馨邮（Procambarusclarkii)，俗称龙邮、小龙邮，隶属节肢动物Π、甲壳 纲、十足目，是具较高经济价值的水产养殖品种之一；同时，克氏原馨邮还具有成本低、易饲 养、体型较大易于实验操作等优点，因此是研究邮蟹类卵巢"眼柄切除效应"分子机制的一 种非常好的代表动物。
[0004] CaM蛋白是细胞内Ca2+信号传导途径中的主要信号转导分子，介导调控由化2+引 起的一系列生理生化反应，参与并调节细胞的增生、分化、运动等基本代谢过程，是巧信号 通路（calciumsi即alingpathway)的核屯、调控分子之一。我们前期的研究表明calcium signalingpathway在克氏原馨邮"眼柄切除效应"的卵巢发育早期很可能发挥重要调控作 用。深入研究克氏原馨邮calciumsi即alingpathway在眼柄切除诱导卵巢快速发育成熟 中的作用和调控机制，首先需要获得大量高活性的克氏原馨邮CaM蛋白，并用W制备CaM蛋 白单/多克隆抗体。因此我们采用生物安全级的枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)重组 表达系统，构建高效分泌表达克氏原馨邮CaM蛋白的基因工程菌，同时建立高产量发酵方 法，为后续深入研究克氏原馨邮卵巢"眼柄切除效应"的分子机制奠定基础。
【发明内容】
阳0化]本发明要解决的技术问题是提供一种高效分泌表达克氏原馨邮CaM蛋白的基因 工程菌，是将克氏原馨邮CaM基因WPMA0911为表达载体，W枯草芽抱杆菌为宿主构建得到 的基因工程菌，所述枯草芽抱杆菌是B.subtilisWB400、WB600或WB800中的一种。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽抱杆菌是B.subtilisWB600。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，成功分泌表达了克氏 原馨邮CaM蛋白，主要包括W下步骤：（1)PCR扩增或化学合成CaM基因序列，（2)将CaM基 因与表达质粒PMA0911 (wapA)连接，构建重组质粒pMA0911-CaM; (3)随后将pMA0911-CaM 转化枯草芽抱杆菌表达菌株WB600,筛选验证获得阳性转化子。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，表达质粒PMA0911自身信号肤替换为wapA信号肤。
[0009] 本发明的第Ξ个目的在于提供应用上述基因工程菌分泌生产CaM蛋白的方 法，主要包括W下步骤：将重组菌用种子培养基活化后，W5-8%接种量菌液转入装液量 50% -60%的发酵罐中，通气量0. 8-1.Ovvm，揽拌转速300-400;r/min，pH不作控制，37°C培 养；发酵培养基成分为玉米淀粉14-22g/l，蛋白腺8-12g/l，酵母抽提物9-15g/l，硫酸铜 0.ImM。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，将重组菌用种子培养基活化后，W5%接种量菌液转 入装液量1.化的化发酵罐中，通气量1.Ovvm，揽拌转速40化/min,抑不作控制，37°C培养； 发酵培养基成分为玉米淀粉18g/l，蛋白腺lOg/l，酵母抽提物12g/l，硫酸铜0.ImM。
[0011] 本发明还提供一种高效分泌表达克氏原馨邮CaM蛋白的方法，W重组表达了克氏 原馨邮CaM基因的枯草芽抱杆菌为生产菌株，发酵生产克氏原馨邮CaM蛋白。
[001引在本发明的一种实施方式中，将CaM基因与表达质粒PMA0911 (wapA)连接，构建重 组质粒pM0911-CaM，然后转化枯草芽抱杆菌表达菌株WB600,获得重组菌；发酵培养基成 分为玉米淀粉14-22g/l，蛋白腺8-12g/l，酵母抽提物9-15g/l，硫酸铜0.ImM;于37°C通风 发酵。
[0013] 本发明相比现有技术的有益效果：本发明首次W枯草芽抱杆菌为表达宿主，实现 了克氏原馨邮CaM蛋白的高效分泌表达，重组CaM蛋白的表达量约占上清液总蛋白量的 65%，产量约0. 853mg/mU目前国际上无任何有关重组表达克氏原馨邮CaM蛋白的报道。考 虑克氏原馨邮CaM蛋白的附加值，本发明表达水平已达到工业化生产要求。
【具体实施方式】
[0014] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0015] 下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，运些实施例只是为了举例说明本发明，而非W任何方式限制本发明的范围。
[0016] 在W下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0017] 实施例1重组质粒pM0911-CaM的构建。
[0018]克氏原馨邮CaM基因的序列如SEQIDNO. 1所示（GenBank登录号：FJ179169)，设 计引物CaM-1 :巧'-TCAGGAGAATTCATGGCGGATCAGCTTACCGAAGAAC-3')和CaM_2 :巧'-ACT GAGGGATCCCTACTTTGAGGTCATCATTCTCACA-3')，利用PCR将CaM基因的DM编码框 5 ' 和 3 ' 两侧分别引入EcoRI和Ba^lIII限制性酶切位点（下划线表示）；通过双酶切、分子连 接等基因操作将CaM基因插入到表达质粒pMA0911 (wapA)，构建重组质粒pMA0911-CaM。
[0019]实施例2SDS-PAGE分析B.subtilisWB600基因工程菌分泌表达的克氏原馨邮 化Μ蛋白。
[0020] 在卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养基中接种基因菌单克隆，37°C、100r/min 培养过夜。随后将100μL过夜培养的菌液接种于100血（含50μg/mL卡那霉素与0.ImM 硫酸铜）的发酵培养基中，37°C、200r/min摇床培养2地，随后取出发酵液，80(K)r/min离屯、 lOmin得到上清液，即为粗酶液。进一步利用离子交换层析法对粗酶液进行分离纯化。取 粗酶液和纯化后的酶液进行12%的SDS-PAGE蛋白电泳。上述相关方法均采用常规操作步 骤。
[0021] 实施例3发酵培养基条件的优化。
[0022] 对发酵培养基中的玉米淀粉、蛋白腺及酵母抽提物浓度进行优化实验，并对发酵 最佳溫度进行研究，玉米淀粉浓度为18g/L时CaM蛋白产量最高，达到0. 624mg/mL;蛋白腺 浓度为lOg/l、酵母抽提物浓度为12肖/1、发酵溫度37°C时，CaM蛋白产量可进一步提高到 0. 769mg/mL左右。
[0023] 实施例4利用摸索出的最优发酵条件进行化发酵罐规模的克氏原馨邮CaM蛋白 发酵生产。
[0024] 重组菌用种子培养基活化后，菌液转入巧％接种量）化发酵罐，装液量1.化，发 酵培养基成分为玉米淀粉18g/l，蛋白腺lOg/l，酵母抽提物12g/l，硫酸铜0.ImM。通气量 1. Ovvm，揽拌转速40化/min,抑不作控制，37°C培养3化后发酵结束，此时发酵液中克氏原 馨邮CaM蛋白产量最高，约0. 853mg/mL。SDS-PAGE分析发酵上清液总蛋白显示明显特异表 达条带，条带分子量与预期大小分子量~16. 5kD-致。在此条件下，重组克氏原馨邮CaM 蛋白的表达量约占上清液总蛋白量的65 %，全为可溶性活性状态。
[00巧]虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种高效分泌表达克氏原螯虾钙调蛋白（CaM)基因的基因工程菌，其特征在于，是 将克氏原螯虾CaM基因以pMA0911为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工 程菌，所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌WB400、WB600或WB800中的一种。2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述CaM基因的序列如SEQID NO. 1所示。3. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilis WB600〇4. 一种构建权利要求1-3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步 骤：（l)PCR扩增或化学合成CaM基因序列；（2)将CaM基因与表达质粒pMA0911连接，构建 重组质粒pMA〇911-CaM ;(3)将重组质粒pMA0911-CaM转化枯草芽孢杆菌，筛选验证获得阳 性转化子。5. 权利要求1-3任一所述基因工程菌在分泌生产CaM蛋白中的应用方法。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：将重组菌用种子培养 基活化后，以5-8%接种量菌液转入装液量50% -60%的发酵罐中，通气量0. 8-1.Ovvm，搅 拌转速300-400r/min，pH不作控制，37°C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉14-22g/L，蛋白 胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸铜0.ImM。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将重组菌用种子培养基活化后，以5%接 种量菌液转入装液量1.6L的3L发酵罐中，通气量1.Ovvm，搅拌转速400r/min，pH不作控 制，37°C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物12g/L，硫酸铜 0· lmM〇8. -种高效分泌表达克氏原螯虾CaM基因的方法，其特征在于，以重组表达了克氏原 螯虾CaM基因的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产重组钙调蛋白CaM。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将CaM基因与表达质粒pMA0911连接，构 建重组质粒pMA〇911-CaM，然后转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600,获得重组菌；发酵培养 基成分为玉米淀粉14_22g/L，蛋白胨8-12g/L，酵母抽提物9-15g/L，硫酸铜0.ImM;于37°C 通风发酵。
【专利摘要】本发明公开了一种高效分泌表达克氏原螯虾钙调蛋白(CaM)基因的方法，属于生物工程技术领域。本发明以克氏原螯虾CaM基因，构建分泌表达载体pMA0911-CaM并转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600中，通过培养条件优化，在3L发酵罐中实现了高效分泌表达。本发明利用基因工程方法高效制备出大量高活性克氏原螯虾CaM蛋白，为后续深入开展克氏原螯虾卵巢“眼柄切除效应”分子机制的研究奠定了基础。
【IPC分类】C12N15/75, C12R1/125, C12P21/02, C12N1/21
【公开号】CN105255799
【申请号】CN201510652256
【发明人】管政兵, 水燕, 廖祥儒, 蔡宇杰, 赵宏
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月10日