一种提高荔枝焦核率的菌液和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及农业技术领域，更具体地，设及一种提高慕枝焦核率的菌液和方法。
【背景技术】
[0002] 慕枝是我果南方的特色水果，种子大小是影响慕枝果实品质的重要性状之一，焦 核慕枝可食率高，口感也较好。焦核率是评估慕枝品质的一个非常重要的指标。目前栽培 的优质慕枝品种如广东的懦米機、桂味；福建的兰竹、绿荷包，广西的灵山香慕等，均W焦核 为特征。
[0003] 大核慕枝品种市场售价低，部分败育品种如桂味，因焦核率不同价格也有较大差 异，种子大小直接影响慕枝的价格和慕农的经济效益。有研究发现使用青鲜素可有效提高 慕枝的焦核率，然而，青鲜素处理常导致严重的幼果脱落或成熟果实偏小，不具商品价值等 不良影响，无法在生产上使用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提高一种提高慕枝 焦核率的菌液和方法。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案予W实现的：
[0006] 一种提高慕枝焦核率的菌液，所述菌液为含有沉默表达载体的LcCWAIs基因片段 转化获得的农杆菌工程菌。
[0007] 本发明通过病毒介导的基因沉默表达技术，将LcCWAIs基因片段和病毒载体结合 令LcCWAIs基因沉默表达，最终可获得使慕枝种胚败育的效果，因此，构建LcCWAIs基因的 沉默表达载体，再转化农杆菌，即可获得一种提高慕枝焦核率的菌液。
[000引优选地，所述LcCWAIs基因片段的序列如SEQIDNO:1所示。
[0009] 优选地，所述沉默表达载体为pTRVl和PTRV2。
[0010] 本发明还提供一种提高慕枝焦核率的方法，是利用上述菌液浸染慕枝植株。
[0011] 优选地，所述慕枝植株为盛花期的植株或花后3周前结有幼果的植株。
[001引优选地，所述菌液的ODe。。为0. 5~1. 5。
[0013] 优选地，所述浸染的方式为喷洒、浸没、注射。
[0014] 另外，申请人通过研究发现，对于不同的慕枝品种，所述浸染液的浸染方式有所不 同，例如，可W在慕枝盛花期浸染花穗，也可W在慕枝盛花期对花穗进行喷洒，也可W在慕 枝盛花后3周前通过注射的方式将浸染液注射入果柄或种柄。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0016] 本发明提供了一种提高慕枝焦核率的菌液，所述菌液为含有沉默表达载体的 LcCWAIs基因片段转化获得的农杆菌工程菌；利用所述菌液浸染慕枝植株，有效抑制了大 核慕枝品种种子的发育，提高了大核慕枝的焦核率，该方法简单，成本低，经实验验证对果 核的调控有着较成功的效果，并且沉默效果仅维持半个月，仅在种子发育期起作用，过后自 动失效，不会有残留，不会对后期的果实生长产生影响，在生产上有着广泛的应用前景。
【附图说明】
[0017]图1为部分慕枝组织RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1~4为慕枝叶片 样品，泳道5~8为慕枝种皮样品，泳道9~12为慕枝种柄样品，泳道13~14为慕枝花的 样品，泳道15~16为慕枝种仁样品。
[0018] 图2慕枝和其他植株种类CWAI基因进化树分析。
[001引 图3为TRV1 (a)和TRV2化）结构示意图，其中，RdRP为RNA依赖的RNA聚合酶；1服 为富含半脫氨酸的16kDa蛋白；Mp为运动蛋白；Cp为衣壳蛋白；MCS为多克隆位点。
[0020] 图4为"9911"沉默处理后种子重量分布（A)和种子发育情况做；其中，图B中， 第一排是pTRV2-LcCWAI处理；第二排是PTRV2处理。
[0021] 图5为"硬枝早红"沉默处理后种子发育情况（A、B)果重和种子重量分布（0,其 中，图A和图B中，第一排是pTRV2-LcCWAI处理；第二排是PTRV2处理。
[0022] 图6为"马贵慕"进行处理后各处理浓度对种子重量的影响。
[0023]图7为"马贵慕"进行各梯度浓度处理后种子败育情况。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[00巧]实施例1酸性转化酶基因筛选和克隆
[0026] -、慕枝样品RNA的提取W及质量检测
[0027] 采用华越洋超快型RNA提取试剂盒（具体方法参照说明书）对"妃子笑"、"黑叶" 和"懦米機"慕枝的叶片、花、果皮、果蒂、种皮、种仁等组织的RNA进行提取，RNA的浓度用紫 外核酸蛋白检测仪，取1μ1测定260皿与280皿的比值，若介于1. 80~2.00之间则可W 进行下一步实验。如果RNA浓度较高，可W稀释一定倍数后检测。
[002引琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，可W看出RNA呈现出清晰的28S和18S两条带， 并且28S的亮度是18S的两倍左右，没有拖尾现象，无DNA污染。表明提取的RNA质量比较 高，无明显降解，满足后续实验的需要。
[0029] 二、细胞壁酸性转化酶基因的筛选和聚类分析
[0030]根据慕枝基因组测序结果，调出注释为Cellwallinvertase的相关基因（一共 14个），经NCBI比对（与其他物种中相关酸性转化酶基因比对）和生物信息学分析软件分 析，利用MEGA5进行聚类分析后删除同源性较差的个别成员，用生物信息学在线分析网站 Smart工具化ttp://sma;rt.embl-heide化erg.de/)删除掉一些不具备完整功能或者基因 组注释错误的成员，最后筛选出5个结构完整，与细胞壁酸性转化酶的氨基酸保守功能域 一致的基因LcCWAIs(表1，转化酶基因Genbank分类号见表2)，分别为LcCWAIl、LcCWAI2、 LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,对慕枝和5个其他品种已报道的CWAI、SAI和细胞质中性/碱 性转化酶（NI)基因用MEGA5进行聚类分析（图2)，可W看出基因LcCWAIs大致聚成Ξ类， NI基因聚成一类，液泡酸性转化酶聚成一类，CWAI的5个基因和其他物种已报道的细胞壁 酸性转化酶基因聚在一起，表明筛选出的基因确实是CWAI基因。慕枝的CWAI又被归成Ξ 小类。其中LcCWAIl聚成一类，LcCWAI2聚成一类，LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5比较相近聚 成一类。
[0031] 表1慕枝细胞壁转化酶基因LcCWAIs的基本信息
[0032]
[0033] 表2用于进化树构建的转化酶类基因GeneBank分类号[0034]
[0035]
[0036]
[0037] |立、细胞壁酸性转化酶基因lIcCWAIs
的克隆~' '
[0038] (一）LcCWAIs克隆
[0039] 分别提取"黑叶"、"妃子笑"和"懦米機"叶片的RNA，WRNA为模板反转录合成 cDNA，之后利用M-MLVFirstcDNASynthesisKit(invitrogen公司）WcDNA为模板，根据 慕枝基因组测序结果中LcCWAIs的全长序列，用PrimerPremier5. 0软件分别于其起始子 和终止子处设计引物（引物序列如表3,委托生工生物工程（上海）有限公司合成），扩增 目的基因的全长；使用东洋纺生物科技有限公司的KOD-Plus-NeoTaq聚合酶，具体反应体 系参照说明书。扩增条件为94°C，2min;98°C，10s，55°C(其中LcCWAIl退火溫度为57°C)， 30s，72°C，2min，35个循环；72°C，10min。反应结束后取2μl跑胶检测扩增产物是否正确。
[0040] 表3慕枝LcCWAIs基因的全长扩增引物
[0041]
[004引（二）PCR产物加A和目的基因的回收
[0043] 由于K0D为平末端聚合酶，为进行TA克隆需在PCR产物的3'端加一个A，因此对 PCR产物进行加A解育，反应体系为0. 1μ1ExTaq，3yllOXExTaqBuffeHTaKaRa)，在 72°C解育半小时。
[0044] 根据目的片段的特异性来决定是进行产物纯化还是切胶回收，若目的片段特异， 采用PCR产物纯化试剂盒（生工生物），具体方法参见试剂盒说明书。若目的片段不特异， 将产物全部进行普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下进行切胶，然后用DNA凝胶回 收试剂盒（生生生物）进行回收，具体方法参加试剂盒说明书。回收完成后，取2μ1跑胶 检测。
[0045] (Ξ)载体连接与转化
[0046] 取适量检测正确的PCR产物与克隆载体PMD19-TaaKaRa)进行连接，目的片段与 克隆载体的摩尔比控制在3~5:1之间。连接体系包括1μ1 19-Tvector、适量纯化后的 PCR产物、5μ1LigationsolutionI(TaKaRa)，加双蒸水补至10μ1，混匀后在16°C条件下 恒溫连接过夜。
[0047] 将感受态细胞D册α(Vazyme)从-80°C取出并置于冰上融化，将2μ1连接产物加 入到30μ1感受态细胞中，轻轻敲打，冰浴30min，然后于42°C水浴热击90s，取出置冰上 稳定3min左右后加入不加抗生素的S0C培养基500μ1，37°C震荡培养比。400化pm离屯、 3min，留下约100μ1上清，用枪头将菌体重悬浮后涂于含有100μgmliAmp+的LB平板上， 37 °C培养箱中倒置培养过夜。
[0048]用灭菌的牙签从平板上挑取单菌落接种于含有100μgmliAmp+的LB液体培养基 中，在37 °C恒溫震荡摇床震荡培养6~化后，跑菌液PCR检测阳性克隆。菌液PCR方法为： 在PCR管中加入8μ1水，1μ1菌液混匀后在100°C条件下加热5min，待恢复室溫后，往PCR 管里加入 2μ1 10XBuffer，0. 8μ1 2. 5mMdNTPs，0. 2ylrTaq酶，扩增条件为 95°C30s， 55°C30s，72°C2min。扩增结束取2μ1产物跑胶检测，挑取扩增产物条带大小正确的送去 测序（测序委托艾基生物技术有限公