一种表达nad(p)h氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种表达NAD(Ρ)Η氧化酶提高重组枯草芽抱杆菌乙酷氨基葡萄糖产 量的方法，属于遗传工程领域。
【背景技术】
[0002] 乙酷氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物W及 动物体内。在人体中，乙酷氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软 骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酷氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加 来治疗和修复关节损伤。此外，乙酷氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目 前，乙酷氨基葡萄糖主要采用酸解邮壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污 染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
[0003] 枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化 学品的生产宿主，其产品被FDA认证为"generallyregardedassafe" (GRA巧安全级别。 因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽抱杆菌是生产食品安全级乙酷氨基葡萄糖的有效 途径。
【发明内容】
[0004] 本发明首先提供一种表达NAD(P)Η氧化酶的重组枯草芽抱杆菌，乙酷氨基葡萄糖 的产量提高。所述重组枯草芽抱杆菌WBSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNAl为出发菌株，同时整合表 达内源NAD(P)Η氧化酶。 阳0化]所述BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GMl，是WΒ.subtilisl68Δna评ΔgamPΔgamAΔnagA Δna浊Μ化Δpta: :lox72为宿主，分别W启动子PxyiA、P43控制glmS、GNAl的重组表达。 [0006] 所述整合表达是W强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，通过同源 重组替换基因组上非必需区域skin。非必需区域skin在Bacillussubtilis168基因组NC_000964. 3 上的位置为 2654942-2701732bp。 阳007] 在本发明的一种实施方式中，重组枯草芽抱杆菌BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNAl的构 建方'法参见文南犬Liu,Y.etal.Modularpathwayen邑ineerin邑ofBacillussubtilisfor improvedN-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng. 23:42-52, 2014。
[0008] 所述NAD(P)H氧化酶的编码基因yodc如NCBI-Gene10:939506所示。
[0009] 本发明还提供一种构建所述重组枯草芽抱杆菌的方法，是 BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNA1为出发菌株，通过同源重组在基因组上W强启动子P43控制 NAD(P)Η氧化酶基因yodc表达。
[0010] 本发明还提供了一种应用所述重组枯草芽抱杆菌发酵生产乙酷氨基葡萄糖的方 法，将37°C、20化pm下培养1化的种子W5%的接种量转入发酵培养基，于37°C、20化pm条 件下培养30h。
[0011] 重组枯草芽抱杆菌种子培养及发酵：
[0012] 种子培养基（g/L):膜蛋白腺10,酵母粉5,化C1 10。
[0013] 发酵培养基（g/L):Glc60,酵母粉6,NH4SO47. 74,K2HPO4· 3&0 12. 5,KH2PO42. 5， CaC〇35，MgS〇43,微量元素 15ml/L。
[0014] 微量元素溶液（g/L) :MnS〇4· 5&0 1. 0, C0CI2·6H2O 0. 4, NaMo〇4· 2&0 0. 2， ZnS〇4· 7&0 0. 2, Aids · 6&0 0. 1，Cuclz · &0 0. 1，H3BO40.0 5,含5M肥1。
[001引培养条件：将37°C、20化pm下培养1化的种子W5%的接种量转入发酵培养基，于 37°(：、200巧111条件下培养30}1。
[0016] 本发明用强启动子P43控制NAD(P)Η氧化酶基因yodc表达，构建yodc表达盒，然 后通过同源重组用上述yodc表达盒替换基因组上非必需区域skin,整合表达内源NAD(P) Η氧化酶W再生NAD(ΡΓ，调控胞内NAD(P) 7NAD(P)Η比例，使胞内氧化还原水平更加有利于 合成乙酷氨基葡萄糖。在使用半合成培养基的摇瓶发酵过程中，表达NAD(P)H氧化酶的重 组枯草芽抱杆菌乙酷氨基葡萄糖的产量达到7.Ig/L，比整合表达前提高31%。本发明为进 一步代谢工程改造枯草芽抱杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽抱 杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
【具体实施方式】
[0017] 乙酷氨基葡萄糖的测定方法： 阳0化]高效液相色谱（册LC)检测法：Agilent1260,RID检测器，HPX-87H柱度io-Rad Hercules,CA)，流动相：5mMH2SO4,流速 0.6mL/min，柱溫 35°C，进样体积为 10μL。
[0019] 实施例1构建yodc表达盒
[0020] 参考 文南犬Genomeengineeringrevealslargedispensablere邑ions inBacillussubtilis.MolBiolEvol.2003Dec;20 (12) : 2076-90.化油 2003Aug29,同时 根据NCBI上公布的枯草芽抱杆菌度acillussubtilis168,购自美国典型微生物保藏中 屯、，ATCCNo. 27370)基因组序列，设计yodc表达盒同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别 为：yodc-skinA-F:5, -GGTCCCTCGATGATTATCACTTTCATAAAATGC-3,和yodc-skinA-R:
[0021] 5 > -CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCGATTGCTGTAGCTGTTGGTGTATTTGGAATTC-3 > ; 右臂上下游引物分别为：yodc-skin-R-F:
[0022] -CCGCTTTCAAAAGTATCAACTTGGCTGTAACTTAGACGCATTTTCCTATGAAAAAAGTCTTGATT TC-3' 和yodc-skin-R-R:5' -CGCTTTTCCTTCTCTGCCCGATAAAACT-3' ；运用上述引物从枯草芽 抱杆菌度acillussubtilis168)基因组中扩增yodc表达盒中包含的左臂和右臂。
[0023] 根据NCBI-GeneID:939506所示NAD(P)Η氧化酶编码基因yodc序列，设计引物扩 增NAD(P)H氧化酶编码基因yodc,上下游引物分别为：P43-sk-yodc-F:
[0024] 5，-CGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGACGAATACTCTGGATGTTTTAAAAGCA CG-3,和P43-sk-yodc-R: 阳0巧]5 >-GAAATCAAGACTTTTTTCATAGGAAAATGCGTCTAAGTTACAGCCAAGTTGATACTTTTGAAAGC GG-3';运用上述引物从枯草芽抱杆菌度acillussubtilis168)基因组中扩增yodc表达 盒中包含的NAD(P)Η氧化酶编码基因yodc。
[0026] 根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列（NCBIaccessionno.抓541492)，设计引物，扩 增博来霉素抗性基因（zeo)，上下游引物分别为：yodc-skin-Z-F:5'-GAATTCCAAATACACCAA CAGCTACAGCAATCGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3，和P43yodc-sk-Z-R: 5，-ATTTAAAAGT TCAAGCGAAAACATACCACCTATCAGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'。
[0027] 根据NCBI上公布的pP4NMK质粒序列（NCBI-GenBank:DQ264732. 1)，设计引物，扩 增强启动子P43,上下游引物分别为：yodc-sk-P43-F:5'-GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCTGATA GGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAAT-3'和yodc-sk-P43-R: 5'-CGTGCTTTTAAAACATCCAGAGTAT TCGTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCG-3 '。
[0028] 通过融合PCR方法，将敲除框左、右臂、抗性基因及NAD(P)H氧化酶编码基因融合 为表达盒。通过测序确认yodc表达盒构建成功。
[0029] 实施例2重组枯草芽抱杆菌的构建
[0030] 将构建好的yodc表达盒转化枯草芽抱杆菌度acillus subtilis 168)，通过博来 霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认yodc表达盒整合成功，得到重组枯草芽抱杆菌。
[0031] 实施例3发酵生产乙酷氨基葡萄糖
[0032] 将37 °C、200巧m下培养12h的种子W5 %的接种量转入发酵培养基，于37 °C、 20化pm条件下培养30h。发酵30h，发酵上清液中乙酷氨基葡萄糖含量达到7.Ig/L。通过 整合表达内源NAD(P)Η氧化酶W再生NAD任Γ，调控胞内NAD任)7NAD(P)Η比例，使胞内氧 化还原水平更加有利于合成乙酷氨基葡萄糖。乙酷氨基葡萄糖的产量达到7.Ig/l，比整合 表达前提局31 %
[0033] 虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以BSGN6-P xylA-glmS-P43-GNAl为出发菌株，在 基因组上整合表达内源NAD (P)H氧化酶；所述BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl，是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ ldh Δ pta: : 1οχ72为宿主，分别以启动子PxylA、P43 控制glmS、GNAl的重组表达。2. 根据权利要求1所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述整合表达是以强 启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，通过同源重组替换基因组上非必需区域 skin。3.根据权利要求1所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述NAD (P) Η氧化酶的 编码基因yodc的核苷酸序列如NCBI-Gene ID :939506所示。4. 一种构建权利要求1-3任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，是以 BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl为出发菌株，以强启动子P43控制NAD⑵Η氧化酶基因yodc表 达，通过同源重组替换基因组上非必需区域skin。5. -种应用权利要求1-3任一所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的 方法，其特征在于，将37°C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于 37°C、200rpm条件下培养30h。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按每L计含有：葡萄糖 60g，酵母粉 6g，NH4S04 7 . 74g，Κ2ΗΡ04 · 3H20 12. 5g，KH2P04 2. 5g，CaC03 5g，微量元素溶液 15ml;微量元素溶液按g/L计含有：MnS04 · 5H20L0,CoCl2 · 6H20 0· 4,NaMo04 · 2H20 0· 2， ZnS04 · 7H20 0· 2,A1C13 · 6H20 0· 1，CuCl2 ·H20 0· 1，H3B04 0· 05,含 5MHC1。
【专利摘要】本发明公开了一种表达NAD(P)H氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1作为出发菌株，首先用强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，构建yodc表达盒，然后通过同源重组用上述yodc表达盒替换基因组上非必需区域skin，整合表达内源NAD(P)H氧化酶以再生NAD(P)+，调控胞内NAD(P)+/NAD(P)H比例，使胞内氧化还原水平更加有利于合成乙酰氨基葡萄糖。在使用半合成培养基的摇瓶发酵过程中，表达NAD(P)H氧化酶的重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖的产量达到7.1g/L，比整合表达前提高31％。为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
【IPC分类】C12R1/125, C12N1/21, C12N15/75, C12P19/26
【公开号】CN105255802
【申请号】CN201510662252
【发明人】刘龙, 陈坚, 堵国成, 李江华, 马文龙, 武耀康
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月14日