0. 05~0. 5mM和0. 002 %~0. 02 %，然后转入28~30 °C，180~22化pm条件下继续培养24~72小时。 阳02引优选地，步骤。所述培养，培养条件为：35°C~37°C，180~22化pm。
[00%] 在另一种实施方式中，本发明提供的利用上述工程大肠杆菌制备异戊二締的方 法，是将构建好的工程大肠杆菌在适宜的培养基中进行活化获得种子液，将种子液W1~ 2:100~130的比例接入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养集中，35 °C~37 °C，180~ 22化pm条件下培养至ODe。。在1. 8~2之间时回收菌体，回收后的菌体用5mL上述培养基 重悬并重新加入含有95mL的盐水瓶中，同时，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为 0. 05~0. 5mM和0. 002%~0. 02%，诱导目的蛋白进行过量表达。然后转入28~30°C， 180~22化pm条件下继续培养24~72小时；定时取培养瓶内培养基上方空气，通过气相 检测产物。
[0027] 发酵生产异戊二締过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选 用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的甲醇；不使用其他碳源或 有机氮源，其他成分为简单的不做特别的限定，例如氮源可选择无机氮源（氯化锭、硫酸锭 等），优选低成本的无机氮源。
[0028] 本发明获得的有益效果如下：
[0029] 本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌具有W甲醇为唯一碳源合成异戊二締的特 点，发酵2地，可W得到343mg/L的异戊二締，甲醇-异戊二締的转换率可达到21. 83%，转 化率为理论转化率的58. 64%。
【附图说明】
[0030] 图1为W甲醇碳源合成异戊二締途径的流程图；
[0031] (图中，实线代表一步反应，虚线代表多步反应）。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0033] W下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0034] 在此，对本发明所使用的合成途径（图1)进行说明。
[0035] 本发明所使用的合成途径包括甲醇代谢途径和异戊二締合成途径。
[0036] W下提及的憐酸戊糖途径和糖酵解途径是大肠杆菌细胞内本身具有的代谢途径。
[0037] 本发明中的甲醇代谢途径，其重要的反应为：利用甲醇脱氨酶激活蛋白ACT激活 甲醇脱氨酶MDH的酶活；利用甲醇脱氨酶MDH将甲醇氧化为甲醒；利用6-憐酸己酬糖合成 酶RmpA，由甲醒和憐酸戊糖途径产生的5-憐酸木酬糖反应生成6-憐酸己酬糖；利用6-憐 酸己酬糖异构酶RmpB，将由6-憐酸己酬糖生成6-憐酸巧喃果糖。
[0038] 6-憐酸巧喃果糖由大肠杆菌本身具有的6-憐酸果糖激酶Pfk和果糖-二憐酸醒 缩酶讯a转化为3-憐酸甘油醒，3-憐酸甘油醒经过糖酵解途径作用后生成丙酬酸。
[0039] 本发明中所述的具有异戊二締途径，是指过表达脱氧木酬糖5-憐酸合成酶基因 dxr，脱氧木酬糖5-憐酸还原酶dxr，异戊締基焦憐酸异构酶idi和异戊二締合成酶基因 Isps，过表达上述基因的重组质粒的构建过程参见专利CN102559769A。 W40] 实施例1基因的获取
[0041] 本实施例中，获取来源于甲基营养型芽抱杆菌的甲醇脱氨酶基因MDH(基因登录 号GI:662720579)的基因序列；6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA(基因登录号GI:40074227) 的基因序列；6-憐酸-3-己酬糖异构酶基因RmpB(基因登录号GI:40074228)的基因序列； 甲醇脱氨酶激活蛋白基因ACT(基因登录号GI:22654851)的基因序列。对W上基因的原有 序列进行密码子优化后由苏州金唯智生物科技有限公司合成。优化后甲醇脱氨酶基因MDH 的序列如SEQIDNO. 1所示；优化后6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA的序列如SEQIDNO. 2 所示；优化后6-憐酸-3-己酬糖异构酶基因Rm地的序列如SEQIDN0.3所示；优化后甲醇 脱氨酶激活蛋白基因ACT的序列如SEQIDNO. 4所示。
[0042] 实施例2重组质粒的制备
[0043] 通过用EcoRI及SacI对实施例1中获得的甲醇脱氨酶基因MDH与质粒PBAD18 进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片段按摩尔比为 1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16°C下连接6小时，获得重组质粒地AD18-1 ; W44] 通过用SacI及化nl对实施例1中获得的6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA与质 粒地AD18-1进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片 段按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16°C下连接6小时，获得重组质粒 地AD18-2 ;
[0045] 通过用Sail及SphI对实施例1中获得的6-憐酸-3-己酬糖异构酶基因RmpB与 质粒地AD18-2进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片 段按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16°C下连接6小时，获得重组质粒 地AD18-3 ; W46]通过用SphI对实施例1中获得的甲醇脱氨酶激活蛋白基因ACT与质粒PBAD18-3进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片段 按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16 °C下连接6小时，获得重组质粒 pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT〇
[0047] 实施例3将质粒地AD18-3与异戊二締合成质粒导入大肠杆菌E.coliJM109(DE3) 合成异戊二締
[0048] 将实施例2所得的重组质粒PBAD18-3与异戊二締合成质粒同时加入到E.coli JM109 (DE3)感受态细胞中；冰浴20min，冰浴后的感受态细胞放入42°C水浴锅热激45s，热 激后立即冰浴2min;在超净台内，加入600μ1灭菌的LB液体培养基到感受态细胞所在的 离屯、管内；将离屯、管置于37°C摇床培养比；摇床培养后，500巧m离屯、2min，用移液枪吸出 上清液，留少许上清液重悬细胞，并涂布于含有卡那霉素和氯霉素的LB固体平板；涂布后 的平板置于37Γ恒溫培养箱，继续培养至长出单克隆。
[0049] 将获得的工程菌株单克隆加入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养基中，在37°C， 18化pm条件下进行活化获得种子液，将种子液W1:100的比例接入W上培养集中继续培 养。菌体浓度生长至ODe。。为2左右，在无菌环境下回收菌体。回收后的菌体用5mL培养基 进行重悬，加入含有95mL培养基的500mL体积的盐水瓶中，同时加入诱导剂IPTG和阿拉伯 糖至终浓度分别为0. 〇5mM和0. 02%，并利用下基橡胶塞密封。转入30°C，ISOrpm条件下继 续培养，诱导目的蛋白进行过量表达。培养24小时后，取培养瓶内培养基上方空气，通过气 相检测产物。
[0050] 经检测，异戊二締的产量为217mg/l，甲醇到异戊二締转化率为9. 4%。
[0051] 实施例4将质粒pBADlS-3与异戊二締合成质粒导入大肠杆菌E.coliBL21 (DE3) 合成异戊二締
[0052] 将实施例2所得的重组质粒PBAD18-3与异戊二締合成质粒同时加入到E.coli BL21 (DE3)感受态细胞中；冰浴20min，冰浴后的感受态细胞放入42°C水浴锅热激45s，热激 后立即冰浴2min;在超净台内，加入600μ1灭菌的LB液体培养基到感受态细胞所在的离 屯、管内；将离屯、管置于37°C摇床培养比；摇床培养后，500巧m离屯、2min，用移液枪吸出上 清液，留少许上清液重悬细胞，并涂布于含有卡那霉素和氯霉素的LB固体平板；涂布后的 平板置于37Γ恒溫培养箱，继续培养至长出单克隆。
[0053] 将获得的工程菌