一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法

文档序号:9501783阅读:844来源:国知局
一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞的分离培养领域,尤其设及一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离 消化液及分离方法。
【背景技术】
[0002] 肌腫是连接骨骼与肌肉的强初的纤维结缔组织。肌腫炎通常是指由于肌肉纤维过 度使用,反复强烈牵拉而引起肌腫胶原纤维退行性病变,除了累及肌腫本身,还可W累及腫 銷。W往诊断常用肌腫炎来统称,但事实上肌腫炎并非单一的炎症,大多数情况下,常合并 为受累肌腫胶原组织变性,因此现在通称为肌腫病。
[0003] 肌腫病在高运动量的人群中常见,W局部疼痛、肿胀、功能障碍为临床特征,常见 发病部位为肩袖、岗上肌、骸腫及跟腫。目前肌腫病的发病机制尚未完全研究清楚,国内外 学者一致认为肌腫内细胞异常增生、细胞外基质的变化是肌腫病发病的基础。2007年美 国学者从人和兔的肌腫中分离出一种具有自我更新能力的细胞,将其命名为肌腫干细胞 (TDSCs)或肌腫祖细胞。2010年香港学者从鼠肌腫中也分离出肌腫干细胞。有学者提出肌 腫干细胞的异常分化可能是肌腫病的发病基础。肌腫干细胞具有多向分化潜能和自我更新 能力,可W分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞。
[0004] 股骨头坏死是骨科常见病、多发病,病程长且致残率高。如何有效地治疗成人股骨 头坏死,防止疾病的进一步发展,保护股骨头,延缓髓关节置换的手术时间,是其治疗的重 点。虽然目前保髓手术的方法很多,如髓忍减压、带血管蒂的脾骨移植、移植骨髓间充质干 细胞、表面置换等,均取得一定疗效,但均具有一定的缺陷,不能完全达到人们的期望。肌腫 干细胞具有明确的干细胞特性,适合修复股骨头坏死的病理过程,因此有望成为治疗股骨 头坏死新的种子细胞。
[0005] 原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞,有人把培养的第1代与传10代W内 的细胞统称为原代细胞。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究, 还可应用于当今热口的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物等的研 究。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用,市场前景广阔。在块状组织的原代分离 中,现有技术主要是W机械研磨或酶消化法得到更小的组织块,再进行组织块培养,筛选出 能生长出单一种类细胞集合的"细胞岛",然后通过扩大培养、鉴定得到纯种细胞。运些方法 主要针对硬度较小的组织,且需要处理的时间大多较长。运些方法在处理像跟腫运样有一 定硬度的组织上效果尚差。如机械研磨法的研磨力度过大会导致目的细胞受损严重,而力 度太小需要较长时间的研磨,最后一样得不到理想的细胞状态,分离率低。酶消化法的消化 条件比较溫和,但是消化时间很长。

【发明内容】

[0006] 有鉴于此,有必要针对上述的问题,提供一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离消化 液及分离方法。
[0007] 一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离消化液,所述消化液为含表面活性剂的酶溶 液。
[0008] 优选地,所述消化液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液。
[0009] 更优选地,所述消化液中I型胶原酶的浓度为l-5mg/mL。
[0010] 更进一步优选地,所述消化液中I型胶原酶的浓度为3mg/mL。
[0011] 优选地,所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
[0012] 更优选地,所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆。
[0013] 优选地,所述表面活性剂的含量为10-30mg/mL。
[0014] 一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离方法,用上述消化液振荡消化跟腫组织,所述 消化液为含表面活性剂的酶溶液。
[0015] 优选地,所述跟腫来源肌腫干细胞的原代分离方法,包括W下步骤:
[0016] S1、将跟腫组织碎块与上述消化液混合,100-17虹pm消化20-40min;
[0017] S2、过滤获得单细胞悬液,250-500g离屯、5min,弃上清,用完全培养基重悬细胞沉 淀,转入培养皿中,于37°C,5%C〇2环境下培养,每3d补液一次,培养至细胞贴壁,贴壁细胞 即为跟腫来源肌腫干细胞原代细胞。
[0018] 优选地,消化液中泊洛沙姆浓度为20mg/mUI型胶原酶浓度为3mg/mL;在37°C、 150巧m条件下消化30min。
[0019] 优选地,所述完全培养基为含10%FBS、100U/mL青霉素、lOOmg/血链霉素的 培养基。
[0020] 优选地,在消化前需要预处理跟腫组织,即将跟腫组织用PBS清洗,剪切成约 1mmX1mmX1mm大小的碎块。
[0021] 优选地,步骤S1中500mg跟腫组织碎块与6血消化液混合,步骤S2中用10血完 全培养基重悬细胞沉淀,转入10cm培养皿中,每3d补液5mL。
[0022] 优选地,所述跟腫组织为人跟腫组织。
[0023] 与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明在消化硬度较大的组织块时, 使用含有表面活性剂的酶溶液作为消化液,表面活性剂可W降低振荡消化过程中细胞受到 的剪切力,从而减少细胞所受到的物理损伤,保证良好的细胞状态;振荡消化可W有效缩短 消化时间,仅消化30分钟就可W得到小的跟腫组织块,消化效率高。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1各实验组和对照组细胞岛数量图。
[00巧]图2为原代细胞在培养皿中的形态图。 阳0%] 图3为原代细胞显微形态图。
[0027] 图4为第3代细胞显微形态图。
[0028] 图5为流式检测图。
【具体实施方式】
[0029] 为了更好的说明本发明,下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得,使用的检测方法等都是本领域所熟知的,在此不再寶述。
[0030] 主要试剂及仪器分别购自如下公司:I型胶原酶购自sigma公司,泊洛沙姆(F68) 购自Gibco公司,FBS购自Gibco公司,L-DMEM购自Gibco公司,青霉素&链霉素购自sigma 公司,离屯、机购自eppendcxrf公司,显微镜购自尼康公司,恒溫培养箱购自SANYO公司。
[0031] 实施例1、人跟腫来源肌腫干细胞原代分离消化液及分离方法
[0032] 人跟腫组织预处理:在无菌环境下用PBS清洗人跟腫组织3次,将5g人跟腫组织 剪切成约ImmXlmmX1mm大小组织碎块;人跟腫组织来自腫断裂患者行跟腫缝合修补术时 修剪的跟腫组织;
[0033] S1、将500mg人跟腫组织碎块与6血消化液混合,37 °C振荡消化30min;所述消化 液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液,所述消化液中I型胶原酶的浓度为3mg/mU表面活性 剂的浓度和振荡转速按照表1所示设置;
[0034] S2、1500;rpm离屯、lOmin终止消化,弃上清,10血PBS重悬沉淀,用70μm滤器过滤 获得单细胞悬液,300g离屯、5min,弃上清,用lOmL完全培养基重悬细胞沉淀,500个/cm2细 胞密度接种至直径10cm的培养皿中,于37°C,5 %C〇2环境下培养8d细胞贴壁,弃去培养液, 即得到人跟腫来
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