一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种藻裂解病毒，尤其是设及一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 赤潮是被公认的海洋环境灾害，对海洋渔业生产和海洋生态平衡表现出很强的破 坏性。赤潮藻体通过水流进入鱼类的觸部，造成鱼类窒息死亡；有些赤潮藻还分泌毒素，鱼 类吞食后，会造成鱼类死亡。另外，藻体死亡后，在分解过程中还会消耗水中的大量溶解氧， 致使大量海洋生物因缺氧而死，导致水质恶化，影响水资源的合理利用。目前国内外除藻方 法主要为物理法、化学法和生物法3大类。物理方法成本高，不能从根本上解决营养成分对 藻类的刺激作用；化学除藻剂虽然具有一定效果，可快速杀死藻类，但会产生二次污染，同 时化学药品的生物富集和放大对整个生态系统的负面影响较大，长期使用低浓度的化学药 物会使藻类产生抗药性，易造成环境污染甚至破坏生态平衡。微生物控藻技术是一种生态 修复技术，其通过强化或减弱系统内藻功能的力度对系统进行调节，具有经济性、有效性、 安全性的特点。微生物除藻技术包括病毒除藻、原生动物除藻和细菌除藻3方面。其中，病 毒控藻技术的主要优势在于它能够强化系统固有生态功能，其利用浮游生物一一病毒回路 的作用，实现营养物向高营养级的传递，恢复生态系统平衡，同时利用病毒感染的特异性， 可将技术的生态风险控制到很低水平，因此该技术有良好的发展前景。
[0003] 中肋骨条藻是一种在全球近岸海域分布极广的广溫广盐性浮游娃藻，在黄、东、南 海均有该种赤潮记录，中肋骨条藻已经成为我国赤潮的优势种。2005年9月23-27日，江 苏海州湾海域赤潮，最大面积为1000km2,主要赤潮生物为中肋骨条藻，直接经济损失500万 _7Π〇
[0004] 将藻类病毒很好地应用到赤潮控制中是非常迫切的，也是非常有发展前景的。自 2004年化gasaki等首次发现刚毛根管藻病毒W来，迄今已有16株娃藻病毒陆续被发现， 但是并未发现能够特异性裂解中肋骨条藻的藻病毒。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种中肋骨条藻裂解病毒及其分离方法和应 用，该裂解病毒可安全、高效、快速、特异性的降解海水中中肋骨条藻，使其藻叶绿素a浓度 减少率达76. 14%。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种中肋骨条藻裂解病毒：该 病毒为ScssDNAV株，分类命名为中肋条藻单链DNA裂解病毒（Skeletonemacostatum single-strandDMvirus),于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCCNo. 10599。
[0007] 该病毒的生物学特征如下：该病毒为球状，直径98±2nm，无鞭毛无外膜包被，单 链DNA分子；该病毒液分别在20°C中放置两周、65°C中放置30min，其活性稳定；在抑3、 抑10环境下，其活性稳定；在紫外线下处理10分钟，活性稳定；在-80°c中反复冻融1、3、5、 7次，其活性均稳定。
[0008] 上述中肋骨条藻裂解病毒的分离纯化方法：将含有中肋骨条藻裂解病毒的水域表 层水样依次经中速滤纸、0. 45μm、0. 22μm滤膜后，经超滤系统浓缩成浓缩水样，其浓缩倍 数为100倍；将浓缩水样与指数生长期的中肋骨条藻按体积比1 :4的比例混合后，在恒溫 光照培养箱中培养7天，培养溫度为20°C，光照强度2500LX，光暗比12h:12h，得到中肋骨 条藻裂解液；然后经0. 22μm的微孔滤膜过滤取滤液，在滤液中加入PEG6000使其终浓度 达到lOw/v%，4°C冰箱内黑暗下放置过夜，第二天将病毒滤液经4°C，36,OOOg离屯、1.化，去 上清，用含有添加量为30mg/L娃酸盐的f/2培养基悬浮沉淀即为纯化的肋骨条藻裂解病毒 液。
[0009] 上述中肋骨条藻裂解病毒的应用，用于抑制中肋骨条藻生长并杀死中肋骨条藻。
[0010] 其对中肋骨条藻NMBguh004-l、NMBguh004-2株具有强裂解作用。
[0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种中肋骨条藻裂解病毒及 其分离方法和应用，将中肋骨条藻裂解病毒用于控制在特定环境下由于中肋骨条藻爆发性 增值或高度聚集而引起的赤潮，此裂解病毒具有高复制率、高感染率的特点，可高效裂解中 肋骨条藻；该病毒具有高特异性，可专一裂解中肋骨条藻，运是保证生态安全的重要前提； 成本低，病毒的高复制率，培养大量中肋骨条藻裂解病毒较为容易；操作简单，且不会造成 环境污染；是一种新型的治理中肋骨条藻赤潮的技术，具有良好的发展前景。
[0012] 综上所述，本发明提供一株中肋骨条藻裂解菌的分离方法和应用，该裂解菌可高 效、快速降解海水中中肋骨条藻，该菌10天能使藻叶绿素a浓度减少76. 14%。
[0013] -种中肋骨条藻裂解病毒：该病毒为ScssDNAV株，分类命名为中肋条藻单链DNA 裂解病毒（Skeletonemacostatumsingle-strandDNAvirus),于 2015年 5 月 25 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCCNo. 10599，，保藏单 位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
【附图说明】
[0014] 图1为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV负染图； 图2为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV经不同抑、溫度、紫外线处理后对中肋骨条藻叶 绿素a的影响； 图3为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV反复冻融后对中肋骨条藻叶绿素a的影响；图中 1、3、5、7分别表不冻融1、3、5、7次； 图4为中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV对中肋骨条藻NMBg址004-2叶绿素a浓度的影 响。
【具体实施方式】
[0015] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016] 一、实验方法 取5mL藻液，6000g离屯、15min后去上清，加入5mL体积分数为90 %的乙醇水溶液或 者体积分数为90%的丙酬水溶液，在4°C冰箱内避光放置。24h后7000g离屯、lOmin，上 清液用分光光度计检测在663nm和645nm时的吸光度，用体积分数为90%的乙醇水溶液 或者体积分数为90%的丙酬水溶液调零。藻叶绿素a浓度利用W下公式计算得到：a= (12.7D谢 3-2.59〇645)*ν/Α a代表藻叶绿素a浓度，V为加入的体积分数为90 %的乙醇水溶液或者体积分数为 90%的丙酬水溶液体积，A为藻细胞重量（g)。藻细胞裂解，藻叶绿素a浓度下降。
[0017] 二、具体实施例 实施例1 中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV的分离、纯化 表层水样采自浙江省宁波市宁海双盘涂水产养殖场，于冰浴下保存，水样依次经中速 滤纸、0. 45μm、0. 22μm滤膜后，经超滤系统浓缩成浓缩水样，其浓缩倍数为100倍。
[001引配制浓缩水样与指数生长期的中肋骨条藻NMBg址004-2按体积比1 :4的比例 混合后，在恒溫光照培养箱中培养7天，培养溫度为20°C，光照强度2500LX，光暗比化/ D) 12h: 12h，得到中肋骨条藻裂解液。将不含病毒的浓缩液与处于指数生长期的中肋骨条藻 共培养作为对照组。分别用肉眼、光学显微镜、藻叶绿素a浓度变化和电镜观察藻生长情 况。
[0019] 选取与对照组相比具有裂解现象的实验组，经0. 22μπι的微孔滤膜过滤，除去中 肋骨条藻裂解碎片。滤液中加入PEG6000使其终浓度达到10% (质量体积百分比），4°C冰 箱内黑暗下放置过夜。第二天将病毒滤液经4°C，36,OOOg离屯、1.化，去上清，用含有添加量 为30mg/L娃酸盐的f/2培养基（中肋骨条藻培养基）悬浮沉淀即为纯化的病毒液。 W20] 纯化的中肋骨条藻裂解病毒该病毒命名为中肋条藻单链DNA裂解病毒 (Skeletonema.costatumsingle-strandDNAvirus,ScssDNAV),于 2015年 5 月 25 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCCNo. 10599。
[0021]其中f/2培养基的成分为：硝酸钢75mg/l，憐酸二氨钢5mg/l，六水合Ξ氯化铁 3. 15mg/l，邸了4-胞2 4. 36mg/l，五水硫酸铜lOmg/L，屯水硫酸锋22mg/L，六水氯化钻lOmg/ L，四水氯化儘18mg/l，二水钢酸钢6. 3mg/L，维生素Bi2Img/L，维生素ΗImg/L，维生素Bi 200mg/l，加人工海水至IL。 阳0巧实施例2 用光学显微镜、电子显微镜观察肋骨条藻裂解病毒的形态 取纯化的病毒感染中肋骨条藻NMBg址004-2,4d后藻液颜色变淡，光学显微镜下观察 藻细胞，发现大部分藻细胞裂解。
[0023] 取实施例1所分离纯化的中肋骨条藻裂解病毒滴于铜网格上，W2%乙酸轴酷溶 液（W/V)进行负染，再置于电子显微镜（日立H-7650)下观察中肋骨条藻裂解病毒的形态。
[0024] 结果如图1所示，中肋骨条藻裂解病毒颗粒系为球状，直径98±2nm，无鞭毛无外 膜包被。 阳〇2引实施例3 不同抑、溫度、紫外线W及冻融对中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV稳定性的影响 (1)不同抑对中肋骨条藻裂解病毒ScssDNAV稳定性的影响 取实施例1分离纯化得到的新鲜病毒液2份，测病毒液原始抑值并记录，随后用0.