一种能使ctab法提取到真菌高质量基因组dna的方法

文档序号:9501817阅读:1968来源:国知局
一种能使ctab法提取到真菌高质量基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物技术领域,具体为一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因 组DNA的方法。
【背景技术】
[0002]DNA是遗传信息的载体,是重要遗传物质。基因组DNA提取作为分子实验中基础 而重要的技术手段应用在各个研究领域。很多研究需要大量实验材料,一定数量及高质量 的DNA样品是进行PCR扩增、限制性酶切、Southern杂交、测序等分子生物学研究的保障。 DNA提取工作量大,而且纯度要求高,DNA的提取质量和效率严重影响实验结果。因此,用合 适的方法获取高质高量的DNA显得极为重要。DNA的提取方法有很多,常用的方法有CTAB 法、SDS法等,运些DM提取方法在原理上基本一致,都是先裂解细胞,再利用有机溶剂进行 多次抽提,使蛋白质等沉淀于有机溶剂中,而核酸保留在水相中。由于不同材料在化学成 分、组织结构等方面的差异,使不同方法对某一具体材料的提取效率差异很大。其中,CTAB 法是一种快速简便的提取总DM的方法,主要采用机械破碎真菌细胞,然后加入CTAB液分 离缓冲液将DNA溶解出来,再经氯仿一异戊醇抽提除去蛋白质,最后得到DNA。对于真菌而 言,其细胞中含有较多的蛋白质、糖类、酪类、脂类、色素及其它干扰物,要获取完整的高质 量DNA,需要一种高效稳定的方法。因此很多科研工作者都在试图寻找一种既快速便捷又能 保证基因组DNA质量的方法。CTAB及SDS法提取DNA的效果虽还算理想,但也有较大的不 足之处,其中,CTAB法虽然可W有效去除真菌材料中的酪类等杂质,但步骤繁琐,耗时过长, DNA提取量不大,使所获DNA浓度及纯度不够高,导致后续实验的成功率受限。SDS法虽可 快速提取基因组DNA应用于分子标记,但提取的DNA仅局限于分子标记等对DNA质量要求 不高的实验,很难满足对DNA质量要求高的分子实验,如基因克隆、分子杂交等。

【发明内容】

[0003] 针对现有技术中存在的上述问题,本发明的目的在于设计提供一种能使CTAB法 提取到真菌高质量基因组DNA的方法的技术方案,该方法能显著提高DNA的含量、质量及得 率,在分子实验中有应用价值。
[0004] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,其特征在于用CTAB 法提取DM的接种时直接用保菌的含目的菌的细沙接种、和/或用配制的抱子悬液均匀涂 板接种后再加入细沙培养、和/或培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样,所有样品均 需磨样至菌丝呈现丝滑状超细粉末时止。
[0005] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,其特征在于用CTAB 法提取DM的接种时直接用保菌的含目的菌的细沙接种、配制的抱子悬液均匀涂板接种后 再加入细沙培养和培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样;具体包括W下步骤: 1)在SDAY平板上铺上一层灭菌后的玻璃纸,加入80-120化的0. 02%吐溫水,再用含保 有目的菌的60-120目细沙0. 05-0. 12g接种至SDAY玻璃纸上; 2) 再取100化用灭菌后的0. 02%吐溫水配制成的1XΙΟ7个/ml的抱子悬液均匀涂板 接种,然后添加60-120目灭菌后的细沙0.05-0. 12g至接种后的平板上,最后24-26Γ培养 2-3 天; 3) 2-3天后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,再加入60-120目的灭 菌后的细沙0. 05-0. 12g,然后再加液氮进行快速研磨2-8min至菌丝最终呈现丝滑状超细 粉末时止,最后按照CTAB法步骤操作,提取过程减少在空气中暴露,所有离屯、过程使用冷 冻离屯、机在3-5°C下离屯、。
[0006] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,其特征在于CTAB 法提取DNA的接种时用保菌的含目的菌的细沙直接接种包括W下步骤: 1) 在SDAY平板上铺上一层灭菌后的玻璃纸,加入100-200化的0. 02%吐溫水,再用 含保有目的菌的60-120目细沙0. 1-0. 4g接种至SDAY玻璃纸上用涂棒均匀涂板,C 培养2-3天; 2) 然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,加液氮进行快速研磨2-8 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止,再按照CTAB法步骤操作,提取过程减少在空气 中暴露,所有离屯、过程使用冷冻离屯、机在4°C下进行。
[0007] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,其特征在于CTAB 法提取DM的抱子悬液涂板后添加细沙方式接种包括W下步骤: 1) 用灭菌后的0. 02%吐溫水配制成1X107个/ml的抱子悬液,取100-200化悬液用 涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上,再添加60-120目灭菌后的细沙0. 1-0.4g 至接种的平板上,然后24-26 °C培养2-3天; 2) 然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,加液氮进行快速研磨2-8 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止,再按照CTAB法步骤操作,提取过程应尽量减少 在空气中暴露,所有离屯、过程使用冷冻离屯、机在4°C下离屯、。
[0008] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,其特征在于CTAB 法用培养的菌丝在提取DM磨样时加入细沙磨样包括W下步骤: 1) 用含目的菌的细沙和/或配制成的1X1〇7个/ml的抱子悬液接种于SDAY平板表面 的玻璃纸上,24-26°C培养2-3天; 2) 然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,加入60-120目的灭菌 后的细沙0.1-0. 4g加液氮进行快速研磨2-8min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末(约 600-1000目)时止,再按照CTAB法步骤操作,提取过程减少在空气中暴露,所有离屯、过程使 用冷冻离屯、机在3-5°C下离屯、。
[0009] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,其特征在于步骤1) 中:加入120-180化的0. 02%吐溫水,再加入80-100目含目的菌种的细沙0. 2-0. 3g至 SDAY玻璃纸上用涂棒涂板均匀,25°C培养2. 5天;步骤2)中:研磨时间为3-7min,优选 为 4-6min。
[0010] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DM的方法,其特征在于步骤 1)中:取120-160化IX1〇7个/ml抱子悬液涂板均匀后,再添加80-100目灭菌后的细沙 0. 2-0. 3g至平板上,25°C培养2. 5天;步骤2)中:研磨时间为3-7min,优选为4-6min。
[0011] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DM的方法,其特征在于步骤1) 中:取120-180化抱子悬液直接用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上,25°C培 养2. 5天;步骤2)中加入80-100目的灭菌后的细沙0. 2-0. 3g加液氮进行快速研磨3-5 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末(约600-1000目)时止。
[0012] 所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,其特征在于所述的 真菌为球抱白僵菌、绿僵菌或蛹虫草等丝状真菌。
[0013] 上述一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法,可W显著提高提取 的DNA的含量,并且对DNA的品质及得率都有显著提高,适用性很强。该方法操作方便,实 验稳定性强,可重复性高,快捷实用,在保证DNA提取质量的同时,可节省磨样时间,即使大 量提取DNA样品时也同样有较高的磨样速率,一般在2-8min内就可W完成磨样,显著缩短 磨样时间,减轻磨样疲劳度,提高样本提取的成功率。而且,提取的DNA经浓度、纯度检测、 PCR扩增、片段克隆、聚丙締酷胺凝胶电泳等分子实验验证,均表明利用本方法提取的基因 组DNA从浓度、纯度、质量完全可应用于需要DNA的分子实验,如分子杂交、基因克隆及分子 标记等。
[0014] 本申请文件中设及的百分含量除另有说明外,其余均为纯物质的重量百分依含 量。
【附图说明】
[0015]图1为实施例1-3提取的基因组凝胶电泳检测结果;实施例1:泳道1-3 ;实施例 2:泳道4-6;实施例3:泳道7-9;M:markerIV;对照ck:泳道11-13; 图2为实施例4-6提取的基因组凝胶电泳检测结果;实施例4 :泳道1-3 ;实施例5 :泳 道 5-7 ;实施例 6 :泳道 9-11;M:markerIV;对照ck:泳道 13-15。
【具体实施方式】
[0016] 下面再结合具体实施例和对比试验对本发明作进一步的说明。
[0017] 实施例1 用灭菌后的0. 02%吐溫水配制成1X107个/ml的抱子悬液,取100化悬液直接用涂 棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上,25°C培养2. 5天。然后刮取玻璃纸上的菌丝 放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,加入60目的灭菌后的细沙0. 3g加液氮进行快速研磨3min 至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末(600-1000目)时止,再按照CTAB法步骤操作,提取过程尽 量减少在空气中暴露,所有离屯、过程使用冷冻离屯、机在4°C下离屯、。
[001引实施例2 用灭菌后的0. 02%吐溫水配制成1X107个/ml的抱子悬液,取150化悬液用涂棒均匀 涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上,再添加70目的灭菌后的细沙0. 1g,25°C培养2. 5 天。然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,加液氮进行快速研磨4min至 菌丝最终呈现丝滑状超细粉末(600-1000目)时止,再按照CTAB法步骤操作,提取过程尽量 减少在空气中暴露,所有离屯、过程使用冷冻离屯、机在4°C下离屯、。
[001引实施例3 在SDAY板上铺上一层灭菌后的玻璃纸,加入120μL的0. 02%吐溫水,再加入80目适 量(0. 2g)含目的菌种的细沙至SDAY玻璃纸上用涂棒涂板均匀;25°C培养3天。然后刮取 玻璃纸上的菌丝放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,加液氮进行快速研磨5min至菌丝最终呈现 丝滑状超细粉末(600-1000目)时止,再按照CTAB法步骤操作,提取过程尽量减少在空气中 暴露,所有离屯、过程使用冷冻离屯、机在4°C下离屯、。
[0020] 实施例4 在SDAY板上铺上一层灭菌后的玻璃纸,加入150μL的0. 02%吐溫水,再加入120目适 量(0. 15g)含目的菌种的细沙至SDAY玻璃纸上用涂棒涂板均匀,25°C培养2天。然后刮取 玻璃纸上的菌丝放入-70°C冰箱预冷的研鉢中,加入液氮进行快速研磨6min至菌丝最终呈 现丝滑状超细粉末时止,再按照CTAB法步骤操作,提取过程尽量减少在空气中暴露,所有 离屯、过程使
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