一种slco1b1 521t＞c的检测引物及其组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种化C01B1 521T乂的检测引物及其 组合物。
【背景技术】
[0002] 由SLC01B1基因编码的有机阴离子转运多肤1B1 (0ATP1B1，又称0ATP-C、0ATP2或 LST1)，在肝细胞摄取和清除内源性和外源性物质如胆汁酸、非结合型胆红素、甲状腺素、他 汀类药物、瑞格列奈、依那普利拉、替莫普利、鄉沙坦、奥美沙坦、甲氨蝶岭和伊立替康活性 代谢产物SN-38等中发挥重要作用。该基因第5外显子521T乂(rs4149056,Vall74Ala) 多态性是亚洲人群中的主要遗传变异，等位基因频率为10~15%，携带521C等位基因的 SLC01B1所编码的0ATP1B1会显著降低其对底物的摄取能力，使他汀类药物如普伐他汀、阿 托伐他汀和罗苏伐他汀等的血药浓度升高。他汀类药物的严重不良反应包括肝功能下降和 横纹肌溶解症等。因此，携带521C等位基因的患者应用辛伐他汀、西立伐他汀时肌病的发 生风险显著增加。为降低他汀类药物严重不良反应的发生风险，《药物代谢酶和药物作用祀 点基因检测技术指南（试行）》中也建议"临床上根据化C01B1基因型选择他汀类药物进行 治疗。"
[0003] 现阶段用来检测rs4149056位点的方法有很多，主要集中于PCR-直接测序法、 化qman巧光PCR法、HRM法、核酸杂交法等等，运些方法虽然都能W相对较短的时间准确得 检测rs4149056,但是都需要依赖比较昂贵的仪器和/或试剂，其中测序法操作耗时长且 灵敏度低；高分辨率溶解曲线法（HRM法）对设备要求较高，临床推广存在一定的困难；传 统巧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法对样本数量W及多态性分布有一定要 求，样本量少时不能准确检测。CN102021239A公开了一种化C01B1基因SNP检测特异性引 物和液相忍片，然而运种方法不仅操作繁琐，检测耗时较长，还需要昂贵的检测设备。因此 运些方法都比较难W广泛推广开来，尤其是在偏远的经济欠发达地区。然而，从目前来看， 运种检测需求又非常巨大，因此，有必要寻求一种检测方法，既能做到费用低廉，又能实现 快速准确得检测。
[0004] 环介导的等溫扩增（LAM巧技术是日本科学家于2000年提出的一种等溫扩增技 术，其主要特点是针对祀基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶度StDNA polymerase)的作用下进行恒溫扩增，仅需15-90分钟即可产生109-10"数量级的产物。具 有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。
【发明内容】
[0005] 本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种化C01B1 521T乂的检测引物及其组 合物，具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。
[0006] 为达到此发明的目的，本发明采用W下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供一种化C01B1基因的检测引物组，所述检测引物组如下：
[0008] 正向外侧引物F3T:沈QIDNO: 1 :TAAGTAGAATAATTAAGAGTTTACAAGT;
[0009] 反向外侧引物B3T:沈QIDN0:2 :CCTTCTTTAGCGAAATCATCAA;
[0010] 正向内侧引物FIPT:SEQIDN0:3:GACCCAGATTCCTTTAMCAACCTATGTGCTAAAATTMT GTTTAAAATGAAACACTC；
[0011] 反向内侧引物BIPT:SEQIDN0:4:TGGTCATGGGTAATATGCTTCGTGGTMGAAAGCCCCMT GGTACT；
[0012] 正向外侧引物F3C:沈QIDN0:5 :AGTAGTTAAATTTGTAATAGAAATGCTA;
[0013] 反向外侧引物B3C:沈QIDN0:6 :CAATTTAATATTTTGTGTACATTACCTAA;
[0014] 正向内侧引物FIPC:SEQIDN0:7:GCCTATATCCACATGTATGACCCAGATTAAAATGAAACAC TCTCTTATCTACATAGG；
[0015] 反向内侧引物BIPC:SEQIDN0:8:CTTCGTGGAATAGGGGAGACTCAAGAAGAATGTCCTTCTT TAGCGo
[0016] 优选地，所述SEQIDN0:l-4所示的序列是用于检测rs4149056 位点的T等位基 因。
[0017] 优选地，所述SEQIDNO:5-8所示的序列是用于检测rs4149056位点的C等位基 因。
[001引本发明中，4条引物的外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3,内侧引 物记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了Flc和F2,BIP包含了Blc 和B2,上述引物均由在线软件PrimerE邱lorerV4设计。本发明在普通LAMP的基础上，W 特异性要求最严格的Flc或Blc的5'端针对rs4149056位点设计等位基因特异引物，分别 检测rs4149056的C等位基因和rs4149056的T等位基因。通过分别在BIPT和FIPC的5' 端第Ξ位引进额外突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。
[0019] 第二方面，本发明提供一种检测化C01B1基因的反应体系，所述反应体系包括第 一方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，径基糞酪蓝，甜菜碱，BstDNA聚合酶，待检样品 基因组DNA和去离子水。
[0020] 优选地，所述反应缓冲液包括Tris-肥1，KC1，（畑4)25〇4,Μ拆〇4和Tween-20。
[0021] 优选地，所述Tris-肥1的浓度为10-30mM，例如可W是10mM、llmM、12mM、13mM、 15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM或 30mM，优选为 15-25mM，进一步优选 为 20mM。
[0022] 优选地，所述KCl的浓度为 10-60mM，例如可W是 10mM、llmM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或 60mM，优选 为50-55mM，进一步优选为50mM。
[002引 优选地，所述（畑4)2504的浓度为5-13mM，例如可W是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、 或 13mM，优选为 8-12mM，进一步优选为lOmM。
[0024] 优选地，所述Μ拆〇4的浓度为2-8mM，例如可W是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或 8mM，优选为2-6mM，进一步优选为4mM。
[002引优选地，所述Tween-20的体积分数为0. 1-1%，例如可W是0. !%、0. 2%、0. 3%、 0. 4%、0. 5%、0. 6%、0. 7%、0. 8%、0. 9%或 1%，优选为 0. 1%。
[0026]优选地，所述dNTPs的浓度为l-2mM，例如可W是 2mM、l. 3mM、l. 4mM、 1. 5mM、1. 6mM、1. 7mM、1. 8mM、1. 9mM或 2mM，优选为 1. 2-1. 8mM，进一步优选为 1. 4mM。
[0027] 优选地，所述径基糞酪蓝的浓度为108-130μΜ，例如可W是108μΜ、109μΜ、 110μΜ、111μΜ、112μΜ、115μΜ、116μΜ、118μΜ、120μΜ、122μΜ、125μΜ、126μΜ、128μΜ 或130μΜ，优选为115-123μΜ，进一步优选为120μΜ。
[0028] 优选地，所述甜菜碱的浓度为0. 1-1Μ，例如可W是0. 1Μ、0. 2Μ、0. 4Μ、0. 6Μ、0. 8Μ或 IM，优选为0. 5-0. 8Μ，进一步优选为0. 8Μ。
[0029] 作为优选技术方案，所述反应体系包括反应体系T和反应体系C，其中每个25μL 反应体系含有W下组分：
[0030] 缓冲液； Tris-HCl 20mM KCl 50mM (NH4)2S04 lOmM MgS〇4 4mM Tween-20 0.1% (体积分数） dNTPs 1.4mM 程基蔡酪篮 120μΜ 甜菜碱 0.8Μ F3T/F3C 0.4μ,Μ B3T/B3C 0.4μΜ FIPT7FIPC 1.6μΜ BIPT/BiPC 1.6μΜ BstDNA聚合酶 8U 待检测样品基因组 化8-4ng/,iiL
[0031] 去离子水加至25μL。
[0032] 第Ξ方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包 括如下步骤：
[0033] 将反应体系Τ和反应体系C所需各组分混合完毕，放置于恒溫水浴锅进行反应，反 应后升溫进行灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。
[0034] 优选地，所述恒溫水浴锅的溫度为55-68。例如可W是55 °C、56°C、57 °C、58 °C、 59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、64°C、65°C或 68°C，优选为 58-6rC，进一步优选为 60°C。
[0035] 优选地，所述反应时间为15-90min，例如可W是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min或 90min,优 选为45-90min，进一步优选为60min。
[0036] 优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：
[0037] 反应体系T为天蓝色，反应体系C为紫罗兰，则待测位点基因型为TT;
[003引反应体系T为紫罗兰，反应体系C为天蓝色，则待测位点基因型为CC;
[0039] 反应体系T为天蓝色，反应体系C为天蓝色，则待测位点基因型为CT。
[0040] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0041] (1)步骤简单：扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒溫水浴锅中进行反应 扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延 伸等变溫过程；
[004引 似高特异性：应用四条引物识别目的片段的六个区域，并且运六个区域的顺序、 长短、退火溫度都有相应要求。扩增的特异性很高，可W根据是否扩增就能判断目标基因的 存在与否，可应用于遗传背景相似的细菌或病毒的分型定性检测；
[0043] (3)扩增反应快速、高效：整个扩增比即可完成，且产率高；
[0044] (4)鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可 W脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上扩增是等溫进行，不用依赖PCR仪复杂的循 环溫度变化来完成，在水浴锅中就能进行，使该技术有着更广阔的应用前景。
【附图说明】