基于dpo引物的实时荧光pcr检测鼠李糖乳杆菌的方法、引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及菌株检测领域，特别设及检测样品如微生物肥料、食品、医用益生菌制 剂等中鼠李糖乳杆菌或者含有鼠李糖乳杆菌DNA的方法W及用于该方法的引物、含有该引 物的组合物和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鼠李糖乳杆菌化actobacillusrhamnosus)是一种广泛使用的益生菌，具有维持 肠道微生态平衡，提高机体免疫力等功效，目前已经被应用于食品、医用益生菌制剂等领 域。近年来，该菌的功能不断被开发，目前鼠李糖乳杆菌已经应用在微生物肥料领域，对运 些产品中微生物的准确鉴定是产品质量控制的重要依据，因此建立一种快速、准确的鉴定 方法具有重要意义。
[0003] 目前鼠李糖乳杆菌的检测主要依靠传统生理生化和分子生物学方法进行。
[0004] 传统生理生化耗时耗力，而且由于乳杆菌属许多种非常相似，生理生化特征也存 在许多相似之处，实际检测过程中难W判断，不能满足实际检测的需要。
[0005] 基于特异性引物的PCR的方法具备快速、准确、低成本的优点，目前被广泛用于转 基因、食源性微生物、医学病原菌等方面的检测。目前PCR法已经被应用于鼠李糖乳杆菌的 检测，Kwon等建立用于检测鼠李糖乳杆菌的特异性引物，但需要另外一对引物将鼠李糖乳 杆菌与干酪乳杆菌区分开；杨小红等建立了普通PCR法检测鼠李糖乳杆菌，并用40株标准 菌株验证了方法的特异性，并将该特异性引物成功转化成为农业部标准NY/T2066-2011。 W往报道的特异性引物检测鼠李糖乳杆菌全部使用的是普通引物，需要严格控制反应条 件尤其是退火溫度，退火溫度的变化可能会影响到引物的特异性，例如农业部标准NY/T 2066-2011中所使用的鼠李糖乳杆菌特异性引物W较高的退火溫度（67°C)来保证引物的 特异性。而不同实验室之间由于仪器、人员等差异，可能会无法精确重复出试验的各项条 件，导致检测特异性受到影响，可能照成误判，而且普通PCR法需要进一步凝胶电泳判断结 果，增加了检测所需时间。
[0006] 实时巧光PCR中使用化qMan探针能检测PCR中的特异性扩增产物，而不受非特异 性扩增产物的影响，因此被广泛应用于微生物的定性及定量检测，但一条有效的巧光探针 需要具备很高的保守性、合适的GC含量和长度、W及合适的Tm值等，而且不同乳杆菌之间 的差异较小，运使探针设计的难度大大增加。另外，探针合成的价格比较昂贵，因而在一定 程度上限制了特异性巧光探针的使用。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力、通用性 和实用性强的基于DP0引物的实时巧光PCR用于检测鼠李糖乳杆菌的方法，本发明还提供 了用于该方法的DP0引物和含有该DP0引物的试剂盒。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0009] 本发明提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQ ID NO :1所示的核巧酸序列，另 一条引物包含SEQ ID NO :2所示的核巧酸序列。
[0010] 本发明还提供了所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途。
[0011] 进一步的，本发明还提供了一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒 中含有权利要求1所述的引物对。
[0012] 所述试剂盒还包括Taq酶和d地2〇,所述Taq酶优选为与SYBR染料预混好的Ex化q 酶。
[0013] 所述试剂盒还包括细菌基因组DNA提取试剂。
[0014] 更进一步的，本发明提供了一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法，包括使用上述 的引物对、上述试剂盒的步骤。
[0015] 上述检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法优选包括如下步骤：
[001引1)实时巧光PCR反应
[0017] W含有DNA的样品为模板与DP0引物进行实时巧光PCR反应，所述DP0引物为SEQ ID NO :1和沈Q ID NO :2 ;
[0018] 2)判断待检样品。
[0019] 优选的，在步骤1)之前还包括DNA的提取步骤。
[0020] 优选的，所述实时巧光PCR反应的反应体系如下：
[0021] SYBR Premix Ex Taq? 10 μL
[002引DPO引物 终浓度为0. 2 μ mol/L
[0023]DNA模板 50ng
[0024] (1地2〇补足至20yL。
[0025] 优选的，所述实时巧光PCR反应的反应体系如下：所述实时巧光PCR反应的程序如 下：95°(：预变性303;95°(：变性53、50-60°(：退火303、72°(：延伸303,35个循环。
[0026] 本发明的有益效果包括：
[0027] (1)本发明针对鼠李糖乳杆菌的gy巧基因设计特异性DP0引物，建立了实时巧光 PCR法，成功实现了种水平的鉴定，其灵敏度高于农业部标准1个数量级。
[002引 似本发明将SYBRGreenI实时巧光PCR和DP0引物检测技术相结合，吸收了DP0 引物高特异性且引物之间难W形成二聚体等优点，成功建立了一种特异性强、灵敏度高、具 备定量能力的鼠李糖乳杆菌的检测方法。
[0029] (3)本发明的DP0引物的特异性在较低退火溫度（50°C)和较高的退火溫度下 (6(TC)下结果均与农业部标准一致，运大大增强了本发明的DP0引物和方法在不同实验室 之间的通用性。
[0030] (4)本发明将DP0引物和SYBRGreenI的实时巧光PCR结合起来，检测结果易于 判断，无需凝胶电泳，运也增强了本方法的实用性。
【附图说明】
[003。 图1是基于DP0引物的鼠李糖乳杆菌的实时巧光PCR的扩增曲线，其中横坐标为 循环数，纵坐标为巧光值，其中1-12分别代表表1中1-12号菌株。
[0032] 图2是采用本发明的DPO引物对梯度稀释的鼠李糖乳杆菌的DM进行实时巧光 PCR的灵敏度检测结果，其中从左至右的DNA模板浓度依次为long/μLIng/μ LO.Ing/ μLO.Olng/μL最右为阴性对照。
[0033] 图3为利用农业部标准NY/T2066-2011对梯度稀释的鼠李糖乳杆菌的DM进行 常规PCR的灵敏度检测结果，其中Μ代表MarkerDL2000 ;1-4的DNA模板浓度按顺序从左 至右分别是lOng/μLIng/μ^0.Ing/μ^0.Olng/μL5 为阴性对照。
【具体实施方式】：
[0034] 除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
[0035] 鼠李糖乳杆菌作为益生菌被广泛应用于食品、医药、农业等领域，因此建立运些产 品中鼠李糖乳杆菌的检测方法具有重要意义。在细菌进化过程中，核糖体RNA(rRNA)基因 的进化相对保守，因此被认为是对细菌进行亲缘关系分析的最理想的基因，该基因序列几 乎可W对所有细菌进行属水平上的鉴定。然而，由于16SrRNA基因的高度保守性，对相似 性极高的近源种无法做出进一步区分，很难设计出种特异性引物。单拷贝gy巧基因作为另 外一种看家基因，由于其进化速度较16SrRNA基因快，目前已经被广泛应用于微生物鉴定 中。
[0036] 本发明通过检测鼠李糖乳杆菌的gy巧基因来检测样品中的鼠李糖乳杆菌。由此， 运用本方法可W快速的检测出样品中的鼠李糖乳杆菌。
[0037] 本发明检测鼠李糖乳杆菌的gy巧基因是通过实时巧光定量PCR来实现的。
[0038] 为了实现上述目的，本发明针对鼠李糖乳杆菌的gy巧基因设计了特异性DP0引 物。
[0039] 在一个具体实施例中，所用的特异性DP0引物包含SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2 所示的核巧酸序列。
[0040] 本发明DP0引物的特异性在较低退火溫度（50°C)和较高的退火溫度下（60°C) 下的结果显示与农业部标准一致，运大大增强了本方法在不同实验室之间的通用性。
[0041] 在一个具体方面，本发明设及一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法，该方法包 括：
[004引 1)实时巧光PCR反应
[004引 W含有DNA的样品为模板与DP0引物进行实时巧光PCR反应，所述DP0引物为SEQ IDNO:1 和沈QIDNO:2;
[0044]。判断待检样品
[0045] 在步骤1)之前还可W包括DNA的提取步骤。
[0046] 所述实时巧光PCR反应的反应体系优选如下：
[0047] SYB民PremixExTaqI、； 10.uL DPO引物 巧化巧为0.2ymol/L DNA模板 50ng 加H:0 i;|、记午.20|iL·，
[0048] 所述实时巧光PCR反应的反应体系优选如下：所述实时巧光PCR反应的程序如下： 95°C预变性 30s;95°C变性 5s、50-60°C退火 30s、72°C延伸 30s，35 个循环。
[0049] 上述提到的样品可W包括但不限于是食品、医用益生菌制剂、微生物肥料等。
[0050] 下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，运些实施例仅仅 是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领 域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂 商者，均为可W通过市购获得的常规产品。
[00川 实施例1
[0052] 本实施例提供了样品中鼠李糖乳杆菌的检测方法，包括如下步骤：
[005引步骤一：基因组DNA的提取
[0054] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司，货号为 DP302)对样品提取DNA，参照说明书的要求操作。
[005引步骤二：实时巧光PCR反应
[0056] 实时巧光PCR反应体系如下：
[0057] SYB民PremixExTaq'i、i 10 μΙ. ΟΡΟ引物终浓度为0.2μηιο1/Ι_
[0058] DNA模板 50ng ddH2〇外化中.20,止。
[0059] 所述SYBRPremixExTaq?II灯liRNas細Plus)购自宝生物工程（大连）有限 公司，货号为RR820Q