一种蔗糖转运蛋白基因启动子ZmSUT4pro及其应用

文档序号:9501845阅读:630来源:国知局
一种蔗糖转运蛋白基因启动子ZmSUT4pro及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物基因工程技术领域,具体设及一种薦糖转运蛋白基因启动子及其 应用。
【背景技术】
[0002] 薦糖是绿色植物光合作用中产物之一,从合成部位(源叶)运输到生长器官(即 碳素存储器官,非自养的库器官)如根、花、果实和种子,W支持其生长需要。薦糖转运蛋 白在调节薦糖运输过程中起到不可替代的作用,它们的活性直接影响到植物生长率和作物 产量。目前我们正面临地球人口爆炸性增长,预计到2050年世界人口将增长到90亿,必须 大幅度提高作物产量W满足人类食物需求。运就迫切需要弄清基本的关键膜蛋白运输机 审ij,运对于提高作物产量至关重要(QiristinaK址ηandQiristopherPLGrof.Sucrose transportersofhi曲erplants, 2010, 13:288-298)。薦糖转运蛋白作为植物所特有的一 类跨膜蛋白,在薦糖的运输和分配中发挥重要的生理作用;其表达调控受到转录起始位点 上游的启动子区域的影响。
[0003] 在植物表达载体构建过程中,启动子是尤为重要的,外源基因表达量不足很多时 候是由于启动子引起的,因此选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首 先要考虑的问题。目前在植物表达载体构建过程中多选用组成型启动子。绝大多数双子叶 转基因植物都使用CaMV35s启动子,单子叶植物主要使用来自玉米的ubiquitin启动子和 来自水稻的ActinI启动子。徐子勤等用玉米化i-1启动子驱动外源基因转化玉米研究结 果显示:使用某一植物自身基因的启动子可W降低外源基因在该物种转基因个体中的拷贝 数,进而避免基因沉默现象的发生(徐子勤,薬莉桂,黄宣,等。采用玉米化i-1启动子获得 低拷贝转基因玉米植株[J].生物工程学报,2004,20(1) :120-125。)。
[0004] 玉米等禾谷类作物巧粒是人类粮食及饲料的主要来源。玉米淀粉合成的重要原料 就是薦糖,薦糖转运蛋白基因家族有6个成员,分别位于不同染色体上,其功能具有重叠性 和复杂性。其中ZmSUT4位于3号染色体上。

【发明内容】

[0005](一)解决的技术问题
[0006] 本发明的目的是提供一种植物薦糖转运蛋白启动子ZmSUT4pro及其应用。该启动 子具有组织特异性表达特性,可用于培育转基因植物并控制外源基因的表达特异性和表达 量。
[0007] 为实现W上目的,本发明通过W下技术方案予W实现:
[0008] 本发明所提供的启动子,来源于禾本科玉米属的玉米狂eamays),命名为 ZmSUT4pro,可W是W下核巧酸序列之一:
[0009]1)、序列表中SEQIDNo. 1的核巧酸值NA)序列;
[0010] 2)、与SEQIDNo. 1具有90%W上同源性,且具有启动子功能的DNA序列;
[0011] 3)、65°C下,在6XSSC和0. 5%SDS溶液试剂中,与沈QIDNo. 1限定的DM序列 杂交的核巧酸序列
[001引其中,SEQIDNo. 1序列表中SEQIDNo. 1序列由961个核巧酸组成,即本发明所 述的ZmSUT4pro启动子。
[0013] 含有上述ZmSUT4pro启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。
[0014] 所述重组载体可为重组表达载体,也可为重组克隆载体。
[001引所述重组表达载体为pCAM-ZmSUT4p-GUS,其中空载体为pCAM即为商用的PCAMBIA3300,在ZmSUT4pro启动子的下游连接GUS报告基因。
[0016] 扩增本发明所述的ZmSUT4p启动子全长或其中任意片段的引物也属于本发明的 保护范围。
[0017]所述引物对为ZmS4pFw和ZmS4pRev。
[0018] 含有权利要求启动子ZmSUT4pro在植物表达中的应用。
[0019] 所述在植物表达中的应用具体为在植物根、茎和叶片的表达。
[0020] 所述在植物表达中的应用步骤为:将薦糖转运蛋白基因ZmSUT4pro启动子连接于 载体中的待表达的外源基因序列上游,从而构建重组表达载体,将所述重组表达载体连接 到植物细胞、组织或器官中进行培育,所述外源基因在维管组织中,本发明的启动子存在着 大量与激素应答相关、胁迫应答相关、光反应相关、发育相关、组织特异相关的顺式作用元 件,其中激素应答及维管特异表达调控相关的作用元件最为广泛。构建该启动子的GUS报 告基因表达载体,通过在转基因烟草和玉米进行功能验证,发现该启动子在根、茎叶的维管 组织具有活性。
[0021] 含有所述启动子ZmSUT4pro在植物表达中的应用,是将薦糖转运蛋白基因 ZmSUT4pro启动子连接于载体中的待表达的外源基因序列上游,从而构建重组表达载体,所 述外源基因在维管组织中特异性表达,将所述重组表达载体连接到植物细胞、组织或器官 中进行培育,优选地,所述在植物表达中的应用具体为在植物根、茎和叶片的表达。
[0022] 为了验证该启动子的功能,构建了本发明的启动子驱动GUS报告基因的表达载 体,具体步骤为:根据ZmSUT4pro启动子序列设计片段相对应的包含化ηdIII/BamHI酶 切位点的特异性引物,分别用Hindlll和BamHI双酶切pCAM-UGN和具有SEQIDNo. 1核酸 序列的克隆载体,回收pCAM-UGN载体和ZmSUT4p启动子片段,将两片段连接获得所述重组 载体pCAM-ZmSUT4p-GUS。进行了烟草和玉米转基因分析,确定了该启动子的活性,该启动子 为初皮部特异表达启动子。
[0023] 本发明提供了一个启动子,该启动子可W驱动基因在植物的根、茎、叶和/或花维 管组织中表达。本发明有助于促进人们对玉米发育生长的研究,且为植物特别是禾本科作 物的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间 和市场前景。
【附图说明】
[0024]图1是本发明扩增的玉米薦糖转运蛋白基因启动子ZmSUT4pro的片段电泳结果, Μ表示Marker, 1表示PCR扩增产物,2为空白对照;
[00巧]图2为本发明构建的pCAM-ZmSUT4p-GUS表达载体质粒谱图;
[0026]图3是本发明转pCAM-ZmSUT4p-GUS烟草的GUS基因PCR检测结果,Μ表示Marker, 阳性为质粒DM对照,阴性为空白对照,1-7是除草剂抗性植株,8是野生型烟草;
[0027] 图4是本发明转pCAM-ZmSUT4p-GUS烟草阳性植株的反转录RT-PCR检测结果,Μ表 示Marker,阳性为质粒对照,阴性为水对照,1,2, 5,6分别为转基因除草剂抗性植株;
[002引 图5是本发明野生型烟草(图A)和转pCAM-ZmSUT4p-GUS基因烟草阳性植株(图 B)组织GUS染色分析;
[0029] 图6是野生型吉853(图A)和转pCAM-ZmSUT4p-GUS基因玉米阳性植株ZmSUT4p 11(图B)叶片GUS染色分析;
【具体实施方式】
[0030]W下详细说明本发明的具体实施,所有对实施例的说明不应理解为对本发明保护 范围的限制。
[0031] 下述实施例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0033] 实施例中的烟草(Nicotianatobaccum)为本生烟草;玉米狂eamays)B73测序品 种,吉853为吉林省农科院育种用优良自交系。
[0034] 实施例1:玉米薦糖转运蛋白基因启动子序列的获得
[0035] 1.玉米DNA提取
[0036]W玉米B73叶片为材料,利用Promega公司植物基因组DNA提取试剂盒提取玉米 叶片基因组DNA,具体步骤如下:
[0037]a.叶片组织用液氮冷冻,再用研鉢研磨成很细的粉末,取40mg该粉末放入1. 5血 离屯、管中。
[003引b.加入600μL核裂解液,使用满旋振荡器振荡1-3秒钟,润湿该组织粉末,65 °
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