蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种晒虫基因的dsRNA及其在降低晒虫 存活率中的应用。
【背景技术】
[0002] 晒虫是危害作物生产的主要害虫之一，近年来全球气候变暖、耕作制度变化等因 素使晒虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。据统计，2010~2011年间我 国小麦、玉米、棉花、油菜、大豆等主要作物的晒虫危害面积分别占当年种植面积的62. 5%、 14%、90%、32%和23%。W麦晒为例，麦晒W成若晒聚集在小麦叶部、茎部、穗部等，吸食汁液 造成叶片不规则皱缩、卷曲、失绿，严重时造成植株死亡。麦晒分泌的蜜露附着在植株表面， 降低植株的光合作用，并易诱发煤烟病等。同时，麦晒还是黄矮病毒重要的传播载体，引起 小麦黄矮病流行。据全国农作物病虫监测网预报，2013年我国麦晒危害面积高达2. 5亿亩， 其中河南省麦晒危害面积为5500万亩。目前，晒虫防治W喷洒农药为主，但大量使用农药， 不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。而培育抗虫作物品种是防止晒虫为害的最 有效途径之一，但由于农作物现有种质资源中缺乏有效的抗晒基因，且抗性机制不明确，常 规抗虫育种难W奏效。因此，利用转基因技术培育抗晒新种质，对于保障我国粮食安全和环 境安全具有重要意义。
[0003] 植物介导的RNAi(RNA干扰）技术能特异抑制昆虫特定基因的表达，使昆虫的 生长发育受阻或致死，进而有效控制害虫危害，已成为农作物抗虫基因工程研究的热点之 一。RNAi现象是由dsRNA(double-strandedRNA)介导的一种序列特异性转录后基因沉 默机制，dsRNA进入生物体后被宿主细胞中的Dicer酶切割成21~23nt的siRNA(small inte计eringRNA) ;siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与体 内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-imluced silencingcomplex,RISC),继之RISCW序列互补的方式与勒ImRNA结合并使之降解，造成 祀标基因表达量下降。利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA祀标基因，导致祀标基因表 达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植 物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根惧的转基因玉米，有效缓解了 长期应用化转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中 特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酪的耐受性，试验表明，利用表 达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450 基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能。近年来，RNAi技术在晒虫防 治方面也展示出很好的应用前景。在烟草和拟南芥中表达晒虫必如A基因或丝氨酸蛋白酶 妳况莖因的dsRNA均可显著降低晒虫的繁殖率，进而减轻晒虫危害。
[0004] 鉴于晒虫对农业生产造成的巨大损失，且农作物现有种质资源中缺乏有效的抗晒 虫基因，常规抗晒虫育种难W奏效；挖掘和鉴定新型抗晒基因或晒虫dsRNA，利用转基因技 术培育抗晒新种质，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明提供一种晒虫基因的dsRNA，可利用RNAi技术沉默晒虫 莖因，导致晒虫产生致死效应。
[0006] 为解决W上问题，本发明通过W下技术方案实现： 设计一种晒虫基因的dsRNA，具体为由SEQIDNo:1所示序列的核巧酸和其反向互补 序列的核巧酸组成的双链RNA。对应的，对该序列经简单缺失、修饰等变换后，使其能达到基 本相同抑制效果的核巧酸序列，也应当是与该序列实质上相同的发明。
[0007] 编码所述dsRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围，所述DNA分子的核巧酸序 列如SEQIDNo:2所示。
[0008] 含有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0009] 所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体或重组菌，在如下（1)~(3) 任一项中的应用也属于本发明的保护范围： (1) 防治晒虫或制备防治晒虫的产品； (2) 降低晒虫存活率或制备降低晒虫存活率的产品； (3 )抑制晒虫莖因表达或制备抑制晒虫莖因表达的产品。
[0010] 所述应用为将所述dsRNA导入晒虫，从而实现防治晒虫、降低晒虫存活率或抑制 晒虫莖因表达。
[0011] 在本发明中，所述导入的方式具体为饲喂。
[0012] 更加具体的，所述饲喂方法为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用 所述混合液饲喂晒虫；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度优选为10ng/yL;所述饲喂持 续的时间为2天W上，优选2~8天。
[0013] 活性成分为如下A~C中任一种的产品也属于本发明的保护范围： A、 所述dsRNA; B、 所述DM分子； C、 所述表达盒、重组载体或重组菌； 所述产品具有如下（1)~（3)功能中的至少一种： (1) 防治晒虫； (2) 降低晒虫存活率； (3) 抑制晒虫莖因表达。
[0014] 在本发明中，所述晒虫可为麦晒，所述麦晒为麦长管晒，具体为3龄麦长管晒。
[0015] 在本发明中，所述晒虫莖因的核巧酸含有如SEQIDNo:2所示序列。
[0016] 本发明具有的积极有益的技术效果： 1.实验证明，本发明得到了麦长管晒SaUPcDNA序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方 法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管晒SaUP基因，导致麦长管晒产生致死效应，并且随着 饲喂时间延长，麦长管晒的死亡率均逐渐增加；显然该dsRNA及其对应的表达盒、重组载体 或重组菌等产品在晒虫防治领域有着重要的应用价值。
[0017] 2.众所周知的是，RNAi是根据序列特异性进行基因沉默的，而大多数已知晒虫品 种的SaUP基因序列和麦长管晒SaUP相似性较高(例如只需要有3个2化P的相同序列)，即 可引起相关基因的沉默。因不同类型晒虫的同源基因序列相似性较大，所W本发明dsRNA也可广泛用于其它种类晒虫的防治。
[001引 3.对饲喂后晒虫SaUP基因实时巧光定量PCR研究表明，Saw莖因的表达明显受 到抑制；运表明晒虫莖因的序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗晒性 的应用研究，从而为晒虫的防治和杀灭提供了全新的且安全有效的途径。
【附图说明】
[0019] 图1晒虫莖因和做7前PCR扩增结果； 图中Μ:100bpmarker;1 :份巧2 :麦长管晒。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可市购。
[0021] 下述实施例中所用晒虫为麦长管晒，由中国农业科学院植物保护研究所提供， 饲养晒虫的小麦品种为科农199,将晒虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中（溫度 (20 + 2) °C，湿度60%~80%，光周期L:D=16 : 8)进行繁殖。
[0022] 1631化GFP质粒："倪志勇，徐兆师，刘丽，李连城，柴岩，陈明，马有志.小麦转录 因子TaDREB6基因的克隆及鉴定.麦类作物学报，2008，28:357-363"，公众可从南阳师范 学院生命科学与技术学院获得。
[0023]质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶化細I、仍oRV及HiscribeT7体外 转录试剂盒购自肥B公司，大肠杆菌菌株D册α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，巧aq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，Mi址lutePCRCleaningKit、Mi址luteGelExtraction Kit、RNACleaningKit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。
[0024] 实施例1晒虫基因的dsRNA的获得 (1)麦长管晒总RNA的提取和cDNA的合成 分别取约20头麦长管晒，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNACleaningKit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。
[0025] (2)引物设计与基因克隆 利用PrimerPrime巧.0软件设计引物P1-F和P1-R，由北京华大基因公司合成。绿色 巧光蛋白基因（做巧片段从南阳师范学院生命科学与技术学院实验室保存的1631化GFP质 粒上扩增，利用PrimerPrime巧.0软件设计引物P2-F和P2-R。
[0026]P1-F: 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGCAACAGTCAGCGGAAGTAC-3，（下划线后的序列为 沈QIDNo:2的第1~19位）； P1-R:5'-TAATACGACTCACTATAGGGGTCAACATAACGCCCAAC-3'(下划线后的序列为沈QID No:2的第225~242位的反向互补序列）。
[0027] P2-F:5' -TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGTCAAGTTTGAAGGTG-3'(下划线后的序列为 SEQIDNo:4 的第 1 ~20 位）； P2-R:5' -TAATACGACTCACTATAGGGTTTTGTTGATAATGGTCTGC-3^ (下划线后的序列为沈Q IDNo:4的第206~225位的反向互补序列）。
[0028] 各引物序列中下划线处为Τ7RNA聚合酶启动子序列。 PCR反应体系为：5XPCRBuffer 10 yLdNTP (2. 5 mmol*Li)4 yLPfu 0. 5正向引物（10 ymol?Li)l yL、反向引物（10 μηιο1·??)1 yL、cDNA/做7损粒1 yL， 用(1地2〇补足至50 yL。
[0029] ?0?的反应程序为：941：3111111;941：3〇3,52°(：或551：3〇3,721：3〇3,35个循 环；72°C10min;4°C保存。（P1-F/P1-R的退火溫度为52°C;P2-F/P2-R的退火溫度为55°C) W麦长管晒的cDNA为模板，用P1-F/P1-R作为引物进行扩增，得到282 bp PCR产物(含40 bp的T7启动子序列)，经过测序，该282 bp PCR产物除去两端T7 RNA聚合酶启动子序 列外的序列为SEQ ID No:2(可人工合成)。
[0030] W 1631化GFP质粒为模板，用P2