靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学和生物医药领域，主要设及一种祀向性沉默化oB的ShRNA 序列、引物、应用、ShRNA慢病毒载体及构建方法。
【背景技术】
[0002] RNA干扰（RNAinterference,RNAi)是一种在进化上保守的基因防御机制，即一 种序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTG巧。近年 来，RNAi技术的发展不仅大大推进了人类后基因组计划，还能应用于高通量筛选药物祀基 因，促进基因治疗和新药开发，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟新途径。在过去的几年时间 里，RNAi技术作为一种新基因疗法，已被广泛用于疾病的基因治疗研究领域，例如老年视黄 斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎等。另外，在帕金森病等神经系统疾病W 及肿瘤疾病等方面的治疗研究，也已经取得了有效成果。相比其它治疗手段，RNAi技术对 致病基因的祀向性更强，毒副作用更低，因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十 分重要的意义。
[0003] 肺动脉高压（pulmonaryarteiThypertension,PAH)是由不同病因导致的W肺 血管阻力和肺动脉压力升高为特征的致命性疾病，素有"屯、血管系统的恶性肿瘤"之称。目 前可行的治疗方法有限、昂贵并伴有明显的副作用。临床数据根据表明，化0激酶活性在肺 动脉高压（pulmonaryarte巧hypertension,PAH)患者中明显增高，且与PAH的严重性及 持续时间相关。由此可见，化〇/化〇激酶信号通路在PAH形成中具有重要作用。研究发现， 化〇/化〇激酶信号通路的异常活化，与血管疫李、动脉硬化、屯、力衰竭、屯、肌梗死、高血压及 屯、绞痛等屯、血管疾病的发生及发展关系密切，因此该信号通路可W作为屯、血管疾病治疗的 突破口。动物及临床试验发现，使用通过抑制化〇/化0激酶信号通路的关键因子，可W有效 降低肺动脉压力，改善右屯、室肥厚指数，抑制PAH的发展。
[0004] 目前只有盐酸法舒地尔作为化0激酶抑制剂上市应用于临床，但临床应用化〇激 酶抑制剂存在很多潜在的不良反应，原因主要有击ho激酶在组织细胞中广泛分布，并且抑 制不同组织细胞的化0激酶会产生不同的生理作用；现有的化0激酶抑制剂在抑制化0激 酶同时，对其他蛋白激酶也有抑制作用。
[0005] 因此，现有技术还有待于改进和发展，需研发出效果更好的化0激酶抑制剂，提高 其对化0激酶的专属性和对不同组织细胞的选择性。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种祀向性沉默化oB的ShRNA 序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，旨在解决现有化0激酶抑制剂对化0激酶 的专属性和对不同组织细胞的选择性不够好的问题。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 一种祀向性沉默化oB的shRNA序列，其中，包含针对化oB基因（GeneID:388)设 计的siRNA，其对应的祀位点序列：5'-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3'。
[0009] 一种用于制备如上所述的shRNA序列的引物，其中，引物序列如下：
[0010] 上游引物序列sh化oB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' ；
[0011] 下游引物序列sh化0B-P2 :5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' 。 阳01引一种shRNA慢病毒载体，其中，所述shRNA慢病毒载体用于表达如上所 述的shRNA序列，所述shRNA慢病毒载体包含沉默目的基因化oB的祀位点序列 5' -CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3'。 阳01引所述的shRNA慢病毒载体，其中，所述shRNA慢病毒载体中包含采用W下引物退火 合成得到的sh化oB序列；引物序列如下：
[0014]上游引物序列sh化oB-P1 :5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' ；
[0015] 下游引物序列sh化0B-P2 :5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' 。
[0016] 一种如上所述的ShRNA慢病毒载体的构建方法，其中，包括W下步骤：
[0017] 采用引物退火合成shRNA序列；其中，上游引物序列sh化oB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCA GTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3' ；下游引物序列sh化0B-P2 :5'-AAAACGT GTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'； 阳01引将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上；
[0019] 转入大肠杆菌感受态细胞St油le3,涂LB-Amp平板培养过夜，随机挑取一个单克 隆进行测序验证，构建得到用于表达祀向性沉默化oB的shRNA序列的shRNA慢病毒载体。
[0020] 所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其中，将合成的shRNA序列连接到shRNA慢 病毒载体上的过程包括W下步骤：
[0021] WpCDFl-MCS2-EFl-copGFP载体为模板，PCR扩增得到EFl-copGFP片段，用Mlul 和Afel双酶切PCR产物，插入到同样经过Mlul和Afel双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro上， 得到载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro;
[0022] 用Clal和化〇1双酶切载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro,去憐酸后电泳回收； 用Clal和化〇1双酶切U6启动子，与酶切后的载体pLVX-EFl-copGFP-Puro连接； 阳02引 PCR扩增大肠杆菌CC地致死基因，用化〇1和MluI双酶切后，与经过化〇1和Mlu I双酶切的pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体连接，得到用于表达sh化oB的shRNA慢病 毒载体PLVX-U6-CC地-EFl-copGFP-PGK-Puro;
[0024]用BsmBI单酶切shRNA慢病毒载体pLVX-Ue-cc地-EFl-copGFP-PGK-Puro,将退火 合成的sh化oB序列与pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接。
[0025] 一种如上所述的祀向性沉默化oB的shRNA序列的应用，其中，将所述shRNA序列 用于制备抑制化oB基因表达的生物制剂。
[0026] 所述的祀向性沉默化oB的shRNA序列的应用，其中，所述shRNA序列用于制备治 疗肺动脉高压的药物。
[0027] 有益效果：本发明针对化ο激酶信号通路的关键因子化oB设计了shRNA序列，并 构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默 化oB的表达。鉴于化oB作为一种潜在的肺动脉高压治疗祀点，因此本发明的提供的化oB的 ShRNA及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗肺动脉高压的相关疾病的药物。同时，本 发明证实抑制化oB基因表达可抑制人肺动脉平滑肌细胞（PASMC)的异常增殖和迁移，证明 化oB是一种潜在的治疗肺动脉高压的新型祀点，有利于进一步研究由化〇/化〇激酶信号通 路异常激活所引起的疾病包括屯、血管疾病、神经系统疾病和肿瘤相关疾病发生发展机制。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例4中sh化oB对PASMC中化oB基因的沉默效果图。
[0029] 图2A~2B为本发明实施例5的结果图，显示sh化oB能显著抑制PASMC的异常增 殖。其中，图2A巧光显微镜下观察PASMC细胞增殖实验的结果图，图2B为根据巧光显微镜 观察结果，对细胞计数后分析增殖的检测结果图。
[0030] 图3为本发明实施例6的结果图，显示shRNA能明显降低PASMC的迁移率。图中 显示了PASMC的经常氧和缺氧不同处理状态下的细胞迁移率比较，还显示了缺氧条件下 shcontrol和shlihoB慢病毒载体后细胞迁移率的变化。
【具体实施方式】
[0031] 本发明提供一种祀向性沉默化oB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及 构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，W下对本发明进一步详细 说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032] 本发明公开了一种祀向性沉默化oB的shRNA序列，及其相应shRNA双链的引物、 shRNA慢病毒载体及其构建方法。所述sh化oB慢病毒表达载体经过慢病毒包装后，感染目 的细胞PASMC，能显著沉默化oB的表达，抑制化0信号通路活性，还能通过下调化oB抑制 缺氧引起的PASMC异常增殖，并降低缺氧条件下PASMC的迁移率。该sh化oB通过祀向性抑 制化〇/化〇激酶信号通路的关键因子化oB，能有效降低肺动脉平滑肌细胞的异常增殖和迁 移，作为化0激酶抑制剂的一种，可用于研究肺动脉高压的治疗和相关新药开发。
[0033] 具体地，所述祀向性沉默化oB的shRNA序列包含针对化oB基因（GeneID:388) 设计的siRNA的祀序列：5'-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3'（沈QIDN0:1)。
[0034] 本发明中还提供制备所述祀向性沉默化oB的shRNA序列的引物序列，引物序列如 下：
[0035]上游引物序列sh化oB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3'