一种提高人金属硫蛋白mt4原核表达载体表达量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，特别是设及一种提高人金属硫蛋白MT4原核表达载体 表达量的方法。
【背景技术】
[000引金属硫蛋白（Metallothionein，MT),又称琉基金属结合蛋白。一类非酶蛋白质， 除含有儒（Cd)、锋狂η)的MT外，在自然界也存在含有铜（Cu)、隶化Z)、金（Au)、祕度i)等 元素的MT。MT的蛋白分子内不含有芳香族氨基酸和组氨酸。让MT中50%的金属离子发生 解离的抑值分别为：Zn-MT:3. 5~4. 5 ;Cd-MT:2. 5~3. 5 ;化-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨 基酸，故在280nm处无吸收峰，然而具有与金属相关的吸收峰。去金属的MT在190nm处有 一个吸收峰。所有脊椎动物、多数植物和微生物体内都含有MT。无论是自然产生还是诱导 产生的MT，其氨基酸组成基本相同、主要不同在所含金属及其含量。目前产品主要从兔肝、 马肾、猪肝和微生物（如粗脉抱菌）等中提取。
[0003] 关于金属硫蛋白的功能和开发利用，自1978年到1999年先后在瑞±、日本、美国 共举行了四次国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。1987 年我国将MT列入[863]计划，"八五"、"九五"重大攻关项目，1994年列入国家级[火炬计 划];2003年MT项目被国家科技部列为"国家科技成果重点推广计划项目，1995年联合国 将MT列入向世界各国推荐的生物技术产品。由此可见从国内到国外对MT的研究、开发、推 广、应用的高度重视。
[0004] 关于MT蛋白的生物发酵生产，曾经有用大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌、酵母菌等基 因工程重组方法，但均由于表达量过低而至今未有投入生产。
[0005]MT4在主要存在于人类皮肤组织中。皮肤是人类最大的器官，外界灰尘中和污染物 中（如含铅化妆品中）的重金属可W通过接触皮肤而被吸收，各种福射（如太阳光的紫外 等）可W导致皮肤和皮下产生自由基，从而加速皮肤的胶原纤维、弹性纤维老化（被自由基 氧化）而失去弹性，被氧化的细胞衰老调亡，被氧化的DNA容易突变致癌，因此，皮肤除了有 全身分布的MT1和MT2外，还重点"布防"有MT4,故而MT4具有皮肤组织特异性，是皮肤重 金属入侵防护和延缓皮肤衰老的重要因子，在护肤、延缓衰老、缓解皮肤过敏的抗衰美容日 化产品中有重要用途。
【发明内容】
[0006] 鉴于W上表达量不足的缺陷，本发明的主要目的是利用人工基因全合成的方法将 密码子优化，并且将表达子首尾串联重复4次成为包含4拷贝MT4顺反子的原核巧.coli) 表达载体，用W提高表达量。
[0007] -种提高人金属硫蛋白MT4原核表达载体表达量的方法，包括将含经密码子优化 后的人金属硫蛋白分子MT4的编码区的串联单位在原核表达载体克隆区串联重复4次形成 包含4拷贝人金属硫蛋白MT4顺反子的串联重复区；将含串联重复区的原核表达载体转化 原核宿主细胞；培养并大量繁殖该细胞，利用诱导剂诱导导人金属硫蛋白分子MT4表达。
[0008] 本发明方法还可进一步包括利用现有技术对诱导表达的人金属硫蛋白MT4进行 分离纯化的步骤。
[0009] 其中，每个所述的串联单位优选包括核糖体结合区和经密码子优化后的人金属硫 蛋白分子MT4。
[0010] 每个所述的串联单位还优选包括位于串联单位两端的酶切位点。
[0011] 经密码子优化后的MT4编码区序列优选如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 经密码子优化后的MT4编码区的串联重复区序列如SEQIDNO. 2所示。
[0013] 经密码子优化后的人金属硫蛋白分子的编码区基因序列，其核巧酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0014] 一种用于提高人金属硫蛋白MT4原核表达量的串联重复区，所述的串联重复区由 串联单位重复串联4次组成；所述的串联单位包括核糖体结合区和经密码子优化后的人金 属硫蛋白MT4的编码区。
[0015] 所述的串联重复区序列优选自SEQIDNO. 5~SEQIDNO. 8中的任意一种。
[0016] 一种表达人金属硫蛋白MT4的原核表达载体，所述的原核表达载体含有本发明所 述的串联重复区。
[0017] 本发明具有W下优点：
[0018] 1、所述人MT4蛋白的优化密码子提高了大肠杆菌内该类密码的可获得性。
[0019] 2、所述MT4原核表达载体中MT4表达顺反子增加了近3倍，MT4的平均表达量由 单拷贝时的3. 4%增加到平均8. 9%，表达量增加了 2. 6倍；
[0020] 3、所述MT4原核表达载体表达的MT4蛋白为天然单分子，并非融合蛋白。
【附图说明】
[002。 图1为本发明提供的一种MT4串联结构示意图。
[0022] 注解：示意图中所代表的DNA序列为所构建的原核表达载体的一部分，W "TTpromoter"开始，W"T7te;rminato;r"结束；"Lacoperator"为laci结合位点；"RBS"为 核糖体结合序列。"T7terminator"为T7隧菌体的转录终止信号序列。
【具体实施方式】
[0023]W下结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步说明，但不作对本发明的限 定。
[0024] 采用的技术方案如下：
[00巧]首先，本发明第一步将人MT4共四种亚型的MT蛋白分子翻译成cDNA序列，然后经DM2. 0软件优化MTcDNA的密码子，使其更适合于大肠杆菌的密码子偏好，并且对氨基端 的起始15个氨基酸编码区进行结构优化，避免强二级结构的形成，经密码子优化后的MT4 编码区序列优选如SEQIDNO. 1所示。
[0026] 第二步是用寡核巧酸分步延伸法合成MT4的全长序列，5'端添加化〇1酶切位点， 3'端依次添加Spel---Nhel两个酶切位点，PCR产物经化01/化el双酶切纯化后，定容至 50ng/ul，再将原核表达载体祀T28a(+)经化〇1/化el酶切纯化，定容至10化g/ul。
[0027]第Ξ步，连接与转化：
[0028] mb(或MT2a,ΜΤ3,ΜΤ4)DNA巧Ong/ul) 2ul
[0029]pET28a(+)载体DNA(100ng/ul) 2ul
[0030]lOXT4DNA连接酶缓冲液 lul
[0031]T4DNA连接酶（200U/ul) lul
[0032] 消毒去离子水 4ul
[0033] 1300巧m，离屯、5s，混匀，再同法离屯、一次，室溫静置连接2小时。
[0034] 全部lOul转化JM109感受态菌，经静置30m，热激Im，加入1mlLB后，37度震荡培 养比后，离屯、4m化00化pm，EP离屯、机），弃上清，悬浮沉淀物，均匀涂布于含卡那霉素的软 琼脂平皿上，37度溫箱过夜培养。次日调取克隆，PCR鉴定阳性重组体，阳性克隆经测序分 析正确后，得到包含1拷贝MT4顺反子的克隆。
[0035] 接着进行第一次串联连接：
[0036] 取正确克隆1株，分别用两管做酶切：管-1用酶Spel/BamHI双切，回收大片段 巧.5化左右）作为载体；管-2用酶甜al/BamHI双切，回收23化PS的片段。连接管-1和 管-2的回收产物，经鉴定和DNA测序分析后，得到包含2拷贝MT顺反子的MT4重组表达载 体。
[0037] 第二步串联连接：采用第一步串联连接产物（包含2拷贝MT顺反子的正确克隆）： 管-1用SpelAhoI酶切，回收大片段（载体巧拷贝MT顺反子）；管-2用甜alAhoI酶切， 回收53化PS的DNA片段（包含2拷贝MT顺反子）。再经连接鉴定后，即可得到4拷贝MT4 顺反子的MT4原核表达载体，其中含经密码子优化后的MT4编码区的串联重复区序列如SEQ IDNO. 2 所示。
[0038] 小量摇瓶表达比较：
[0039] 分别取祀T28a(+)空载体、MT单拷贝、2拷贝、4拷贝的重组表达质粒转化 BL21 (DE3)表达菌株，挑取单菌落分别接种4ml2XYT培养基（含50ug/ml卡那霉素）， 37°C，250巧m，震荡培养，待到细菌生长至对数生长期，分别向各管加入0. 4ulIPTG，25°C诱 导培养6小时。收集1ml菌液，离屯、沉淀，PBS洗一次，再用500ulPBS悬浮，超声破碎细 胞，12000巧m/15分钟，4°C离屯、弃沉淀，取上清上样20%SDS-PAGE，经考马斯亮蓝显色，脱 色，凝胶成像仪计算目标条带占总蛋白的比例，结果（如下）显示随拷贝数增加，表达量增 高（按目标条带密度占总蛋白密度百分比计算）。
[0040] 表1.不同MT4拷贝数载体在小量摇菌条件下目标条带密度占总蛋白密度百分比
[0041]
【主权项】
1. 一种提高人金属硫蛋白MT4原核表达载体表达量的方法，其特征在于包括将含经密 码子优化后的人金属硫蛋白分子MT4的编码区的串联单位在原核表达载体克隆区串联重 复4次形成包含4拷贝人金属硫蛋白MT4顺反子的串联重复区；将含串联重复区的原核表 达载体转化原核宿主细胞；培养并大量繁殖该细胞，利用诱导剂诱导导人金属硫蛋白分子 MT4表达。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于每个所述的串联单位包括核糖体结合区和 经密码子优化后的人金属硫蛋白分子MT4。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于每个所述的串联单位还包括位于串联单位 两端的酶切位点。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于经密码子优化后的MT4编码区序列如SEQ IDNO. 1 所示。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其特征在于经密码子优化后的MT4编码 区的串联重复区序列如SEQIDNO. 2所示。6. 经密码子优化后的人金属硫蛋白分子的编码基因序列，其特征在于核苷酸序列如 SEQIDNO. 4 所示。7. -种用于提高人金属硫蛋白ΜΤ4原核表达量的串联重复区，其特征在于所述的串联 重复区由串联单位重复串联4次组成；所述的串联单位包括核糖体结合区和经密码子优化 后的人金属硫蛋白ΜΤ4的编码区。8. 根据权利要求7所述的串联重复区，其特征在于所述的串联重复区序列如SEQID NO. 2所示。9. 一种表达人金属硫蛋白MT4的原核表达载体，其特征在于所述的原核表达载体含有 权利要求9或10所述的串联重复区。
【专利摘要】本发明公开了一种提高人金属硫蛋白MT4原核表达载体表达量的方法。该方法包括：人工合成密码子优化的MT4的DNA分子，该分子还包括DNA内切酶识别序列NcoI、SpeI、NheI；将所述DNA分子构建到pET28a(+)的NcoI/NheI克隆区；再经过系列重组使包含核糖体结合区的MT4编码基因扩增到4拷贝。本发明的方法适用于所有小分子多肽(100个氨基酸以内的)表达载体的构建，整个过程操作简单，快速，所制备的原核表达载体提高了MT4蛋白的表达量，降低了成本，提高了工作效率。
【IPC分类】C12N15/69, C12N15/12, C12N15/70
【公开号】CN105255929
【申请号】CN201510702821
【发明人】李万波
【申请人】盘古基因生物工程(南京)股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月26日