一种高效联产α-氨基丁酸及葡萄糖酸的策略的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种构建葡萄糖脱氢酶与L-氨基酸脱氢酶串联到质粒上并在大肠杆菌中共表达，利用该重组大肠杆菌进行全细胞转化高效制备α-氨基丁酸和葡萄糖酸盐的方法。
【背景技术】
[0002]α-氨基丁酸是一种可以抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸，具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢的作用。α -氨基丁酸作为一种重要的化工原料和医药中间体如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成前体，具有广阔的应用市场。α -氨基丁酸主要通过化学合成法、酶拆分法及酶转化法来制备，在这三种方法之中，微生物酶转化法具有特异性较强，条件温和，对环境友好等优点。微生物酶转化法制备α -氨基丁酸主要是通过利用L-氨基酸脱氢酶对酮丁酸进行转氨催化作用完成，这之中需要辅因子NADH的参与，而辅因子NADH价格昂贵，显然不适用于工业生产中。通过基因工程手段可以在细胞中构建辅酶偶联再生系统，Degussa公司首次利用甲酸脱氢酶提供辅因子NADH的再生并且将其应用到L-叔亮氨酸的制备中，大大提高了产物的转化率。
[0003]葡萄糖酸是化工、医药及食品等产品的重要中间体，可被用来生产葡萄糖酸的衍生物如与钠、钙、锌、亚铁等金属氧化物合成制得的葡萄糖酸盐，也可直接作为一种产品，用在乳品工业上防止乳石沉淀，用在食品配方中作为酸味剂，也用来配制家用或工厂用清洗剂(替代多磷酸盐)、织物加工和金属加工的助剂、皮革矾鞣剂、去藻剂、金属除锈剂、建筑工业上混凝土的塑化剂、生物降解的螯合剂及二次采油的防沉淀剂等。葡萄糖酸的生产主要包括微生物发酵法、电解法和催化氧化法，其中微生物发酵法因其环境友好且能耗较低被广泛采用，但也存在发酵时间长，发酵条件控制严格等问题。
[0004]葡萄糖脱氢酶(Glucosedehydrogenase，缩写GlcDH)作为短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅因子NAD (P) +等存在时能够快速地催化葡萄糖转化为葡萄糖酸同时生成辅因子NAD (P) H。制备α-氨基丁酸过程所需的NADH可通过葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸来获取，α -氨基丁酸与葡萄糖酸的制备过程构建了一个NAD+与NADH的辅因子循环过程，可以达到高效联产α-氨基丁酸与葡萄糖酸的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的主要研究内容:本发明在于将不同来源的葡萄糖脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体pET-28a_Bsglcdh+Bcldh、pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh及 pET-duet-Ppglcdh+Bsadh、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh，并将其转化 E.coli BL21，成功构建了基因工程菌 pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21、pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21、pET-duet_Ppglcdh+Scvdh/BL21。同时将 L-苏氨酸脱氨酶(ltd)基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Ecltd和pET-28a_Seltd，并将其转化Ε.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Ecltd/BL21。在不添加任何外源辅因子的条件下，利用全细胞转化法对廉价底物L-苏氨酸及葡萄糖进行转化高效联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸，为α-氨基丁酸及葡萄糖酸的应用提供了一种有效的策略。
[0006]本发明的技术方案:
[0007]1.引物的设计
[0008]根据不同来源的苏氨酸脱氨酶的基因序列设计引物。
[0009]PEcltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3，(BamH I)
[0010]PEcltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3，(Hind III)
[0011]PSeltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3，(BamH I)
[0012]PSeltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3，(Hind III)
[0013]根据不同来源的葡萄糖脱氢酶的基因序列设计引物。
[0014]PBsglcdhF:5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’ (BamH I)
[0015]PBsglcdhR:5，-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’ (Hind III)
[0016]P28aPromoterF:5，-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3，(Sph I)
[0017]PBsglcdhRBglI1:5，-GAAGATCTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’ (Bgl II)
[0018]PPpglcdhF:5，-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’ (BamH I)
[0019]PPpglcdhR:5，-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’ (Hind III)
[0020]根据不同来源的氨基酸脱氢酶的基因序列设计引物。
[0021]PBcldhF:5’-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’ (BamH I)
[0022]PBcldhR:5，-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATAT C-3’ (Sac I)
[0023]PRjpdhF:5’-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3’ (BamH I)
[0024]PRjpdhR:5，-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’ (Sac I)
[0025]PBsadhF:5，-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3，(Kpn I)
[0026]PBsadhR:5，-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’ (Xho I)
[0027]PScvdhF:5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’ (Nde I)
[0028]PScvdhR:5，-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3，(Xho I)
[0029]2.重组菌的构建
[0030]以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR0采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a或者pET-Duet和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素或卡那霉素的1mL的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0031]以pET_28a为葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时，以连上pET_28a的葡萄糖酸脱氢酶质粒为模板，根据预先设计好的带启动子的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上L-氨基酸脱氢酶的载体pET-28a-ldh和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的1mL的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0032]以pET-Duet为葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶的共表达载体时。先以染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行L-氨基酸脱氢酶的基因PCR，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对已经连上pET-Duet的葡萄糖脱氢酶质粒载体和纯化的PCR产物进行双酶切以，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入氨苄霉素的1mL的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0033]3.重组菌全细胞转化联产α -氨基丁酸和葡萄糖酸
[0034]将获得的菌体用pH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤两次，再加入pH 6.0-8.0的50mMPB缓冲液重悬，然后于30-42°C不同温度下加入底物L-苏氨酸及葡萄糖，以添加一定的化学试剂来控制PH