一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本申请设及基因启动子表达技术，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] Drosha:-种III型核糖核酸酶，通过识别mRNAs中类似于miRNAs前体的二级茎 环结构来定位和切割mRNAs，运在干细胞中抑制基因表达的机制中有重要作用。
[0003] 在生物体内，miRNA的成熟较siRNA双链的形成过程要复杂，概括为：首先miRNA 的前体pri-miRNA在核内由一种称为化osha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构 的Pre州rsormiRNAs(pre-miRNAs)值enlietal.,2004;Gregoryetal.,2004;Hanet al. , 2004);运些pre-miRNAs在Expodin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶 进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs(Lundetal.，2004;Yietal.，2003)。
[0004]CRISPR:规律成簇间隔短回文重复blusteredregularlyinterspacedshort palin化omicr巧eats)，细菌的II型CRISPR/Cas系统逐渐成为同时打祀多个基因位点的 重要工具。
[0005]shRNA:sho;rthai;rpinRNA,"短发夹RNA"。shRNA包括两个短反向重复序列，克 隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop)序列分隔 的，组成发夹结构，由polIII启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终 止子。在活体中输送"小干扰RNA"(siRNA)的一种办法是，将SiRNA序列作为"短发夹"克隆 进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个"双链RNA"(shRNA)， 并被RNAi通道处理。
[0006] 高等生物通常都有复杂的基因网络来确保细胞内的生物活动有条不素的进行。因 此，能够同时打祀多个位点的分子工具对遗传工程的基础研究和实际应用都有巨大意义。 近年来，细菌的II型CRISPR/Cas系统逐渐成为达成运一目的的重要工具。从酿脈链球菌 中分离得到的化s9核酸内切酶通过人工修饰的引导RNA(guideRNA，gRNA)的导向作用可 W打祀DNA序列的5' -N20-NGG-3' (N代表任何脱氧核巧酸碱基），N20是与gRNA的5'序 列相同的20个碱基，NGG是PAM区（protospacer-adjacentmotif)。化s9剪切的位点就是 PAM附近的区域。运种可W人为修饰的导向RNA和基因组中PAM的高发率使得化s9-gRNA 几乎可W打祀所有的基因元件来实现基因组编辑。正是由于它的简单高效性，基于化s9的 基因编辑工具发展迅速，被用于基因组和表观基因组编辑，转录调控和基因工程的其他应 用。
[0007] 从理论上来讲，多基因编辑可W通过化s9和祀向不同位点的多个SgRNA-起表达 来实现。传统的方法通过显微注射或者表达包含多个单一gRNA(SgRNA)的表达盒来实现。 将体外表达的曲NA和化s9蛋白（或者化s9的mRNA)注射到细胞或者胚胎只适用于很少的 一些系统。因此，最理想的方法就是将多个SgRNA的表达盒压缩到一个载体上。一个典型的 SgRNA的表达盒大约是400-5(K)bp，包含RNA聚合酶III任〇1III)的启动子，SgRNA和化1 Ill终止子。受传递方式和质粒载体承载能力的限制，对于大多数生物来说，用运一sgRNA表达方法同时表达多个sgRNA将是一种挑战。而且，真核生物III型聚合酶转录的RNA需 要有一个特定的核巧酸开始，运使得化s9/gRNA祀位点受限。一个好点的方法就是将多个 SgRNA的表达盒压缩到一个合成的基因中，利用一个RNA加工系统从初级转录本中将单个 SgRNA分别剪切出来。应用到运一方法的成功案例只有利用Csy4内切核糖核酸酶和tRNA剪 切系统。（KabinXie,BastianMinkenber邑，Yinon邑Yan邑，Boostin邑CRISPR/Cas9multiplex editingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem,PNAS)然而，还需要 更有效和精确的方法来同时产生多个SgRNAW提高多基因编辑的能力和充分发挥化s9系 统的应用。
[000引细胞中有大量的各种的RNA。在不同组织中，RNA的合成是高度保守的，并且有各 种精细的RNA加工系统来确保其正确的剪切。运一特点启发我们可W用一个有内切酶功 能的RNA加工系统来从一个转录本切出多个SgRNA。最近在植物上的一个研究表明，多个 SgRNA可W由一个tRNA-gRNA结构的合成基因通过内源的RNase的精确剪切产生。化油in Xie,BastianMinkenberg,YinongYang,BoostingCRISPR/Cas9multiplexediting cap油ilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem,PNA巧运一研究说明在植物 中不仅可W实现多基因打祀，而且大大提高了CRISPR/tas9系统用于基因组编辑的效率。 然而，类似的方法在动物中未见报道。
[0009] III型核糖核酸酶（RNaseIII) -直被认为在生物正常表达小RNA(miRNAs)的 过程中有关键作用。多年来，人们一直忽视了它们在其他RNA(例如SgRNA、shRNA等）的 产生过程中的重要作用。作为RNaseIII家族的一员，化osha就可W识别并切割信使 RNA(mRNAs)，并可能在核糖体RNA(rRNA)的加工过程中起作用。Drosha通过识别mRNAs中 类似于miRNAs前体的二级茎环结构来定位和切割mRNAs，运在干细胞中抑制基因表达的 机制中有重要作用。Dicer则可W通过调控许多小干扰RNA(smallinte计eringRNAs， siRNAs)的产生来调苄基因的表达，还可W促使细胞内有害的短RNA片段和病毒的RNA 降解来保护和维持细胞生物活动的正常。（TimothyΜ.Johanson,An化ewΜ.Lew,Mark M.W.Chong,MicroRNA-independentrolesoftheRNaseIIIenzymesDroshaand Dicer,RoyalSocietyPublishging)
【发明内容】
[0010] 本发明就是通过利用化osha的切割位点将多个SgRNA和shRNA的序列串联起来， 通过一个真核细胞的III型启动子启动表达。从而实现同时产生多个SgRNAW提高多基因 编辑的能力和充分发挥化s9系统的应用。
[0011] 本发明是利用一个真核细胞III型启动子扣6或H1)启动由化osha切割位点串 联的多个发卡结构小RNA的表达，在真核细胞内表达后可W产生多个有生物活性的CRISPR SgRNA(本发明的DNA序列图示如下）。WU6-sgRNA-shRNA-sgRNA的结构为例，运种U6启 动表达的结构在一次转录中产生含有多个SgRNA和shRNA的初级转录本，在真核细胞中 运些SgRNA经过加工后可W分别识别各自的祀位点，从而指导化s9蛋白打祀多个位点，为 多基因编辑打下基础。相比于传统的分别表达多个单一gRNA的方法和植物上新近报道的 tRNA-gRNA系统，本发明的结构更简单，构建更方便。此外，本发明还可W通过Golden Gate 的方法继续串联shRNA-sgRNA的序列打祀更多的位点或者表达多个shRNA干扰基因的表 达。
【附图说明】
[001引图1 :本发明DNA序列结构图；
[0013]图 2 :Cas9 表达质粒（pll3. 7-SpCas9(Notl))图；
[0014]图 3:中间载体pcDNA3. 1 (+) -CMV-3RNA质粒图；
[001引 图4 :载体msgRNA-2的质粒图；
[001引图5 :质粒msgRNA-2酶切检测结果；
[0017]图6:双巧光报告载体Re-SSA(CMV).VEGF的质粒图；
[001引图7 :双巧光报告载体Re-SSA牌la).CCR5a的质粒图；
[001引图8 :VEGF位点报告载体检测巧光效果图（实验组和阳性对照组）；
[0020] 图9 :CC贴a位点报告载体检测巧光效果图（实验组和阳性对照组）；
[0021] 图10 :报告载体流式结果分析图。
【具体实施方式】
[0022] 为使本发明的技术方案便于理解，W下结合利用III型启动子U6表达祀向人基因 组VEGF基因和CCR5基因的具体试验对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解 释而不是限定。
[0023] 实施例1祀位点选择
[0024] 基于CRISPR/Cas9系统打祀位点的特点，在基因组中寻找含有PAM(NGG/NGGNG)的 祀位点。再经过〇?15口3〇631即网站化《口:/7^13口户111^.6(111/)的筛选，选择出^下两个 位点作为祀位点：
[00巧]VEGF祀位点片段：
[0026]CTCGGCCACCACAGGGAAGCTGG(SEQIDN0:1)
[0027]CCR5a/CCR2 祀位点片段：
[0028]CACACTTGTCACCACCCCAAAGGTG(SEQIDNO:2)
[0029] 实施例2化s9蛋白表达载体
[0030] 将优化过的酿脈链球菌化s9序列化Sp化s9)插入到骨架载体pi13. 7中。如图2 所示。hSpCas9的序列如下（SEQIDN0:3):
[0100] 实施例3串联多个小RNA表达载体（msgRNA-。
[0101]W实验载体为例，该载体设计为U6-sgRNA-shRNA-sgRNA结构，根据选择的两个革己 位点（VEGF祀位点和CCR5a祀位点），分别设计对应的sgRNA序列，中间用带有化osha祀位 点的CD40shRNA序列。通过不同的限制性内切酶的酶切位点将各个片段连在一起。本实验 使用的两个化osha祀位点序列如下：
[0102] Drosha祀位点片段1:TCCGAGGCAGTAGGCA (SEQ ID NO:4)
[0103] Drosha祀位点片段2:TGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO:5)
[0104] 构建该载体需要两步。第一步，将3个RNA序列的基因片段插入到骨架载 体pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen)上的多克隆位点Miel和Apal之间，各个片段之间分别 通过限制性内切酶EcoRI、化〇1和Apal各自识别位点的序列来连接，即化el-VEGF. sgRNA-EcoRI-CD40.shRNA-XhoI-CCR5a.sgRNA-Apal的结构。两个sgRNA片段通过PCR引入 需要的酶切位点，CD40.shRNA片段通过酶切的方法获得；第二步，用U6启动子替换掉CMV 启动子，最终获得串联表达多个小RNA的载体msgRNA-2。
[0105] 载体的具体构建和检测方法如下：
[0106] 3.1引物的设计与合成
[0107] 分别W包含目的片段的载体为模板，利用CloneManagerV7软件进行引物设计，设 计能够特异扩增VEGF.SgRNA片段的引物化el-VEGF.Sps曲.F和EcoRI-SpsgR.R，能够特异 扩增CCR5a.SgRNA片段的引物)(hoI-CCR5.a.SpsgRNA.F和Apal-SpsgRNA.R，能够特异扩增 U6启动子的引物Primer53(NdeI-册L27-巧和Primer54(SacI-册L27-R)。分别在相应的 位置引入所需的酶切位点。引物序列设计如表1 :
[0108] 表1:实验引物设计表
[0109]
[0110] 其中：引物5'端的黑体斜体表示的碱基为酶切位点，前面的黑色字体为保护碱 基，带下划线的部分为与模板匹配的区域，剩下的黑色字体部分为引入的打祀序列。
[01川3.2 中间载体PCDNA3.1 (+)-CMV-3RNA的构建