一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然药物化学研究领域，涉及一种制备稀有人参阜苷compound K的方法，尤其涉及利用基因工程技术从泡菜乳酸菌中重组的一种全新的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参阜苷compound K的方法。
【背景技术】
[0002]人参皂苷compound K是二醇型人参皂苷，在天然人参中并不存在，而是人参中其他原二醇型人参皂苷在人体肠道内的主要代谢产物，是人参在人体发挥作用的主要活性成分之一。它具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤细胞侵袭、抗过敏、抗炎和抗老化等作用，因此，制备稀有人参阜苷compound K是十分必要的。
[0003]目前，制备稀有人参皂苷compound K常用的方法有:化学法、微生物转化法和酶转化法等。化学法专一性差，反应条件剧烈，糖苷键断裂彻底，水解产物处理复杂且更易带来环境污染问题，并且转化率低；微生物转化法反应周期长，高浓度人参皂苷对菌株有抑制作用，导致工业生产中人参皂苷的投料量不高，无法扩大生产；酶转化法的优点在于条件温和，利于产物的分离纯化，环境污染小和专一性强，但此方法存在一些缺点，成本较高、酶消耗量较大、转化速率达不到工业化要求等。因此，为获得更多人参皂苷转化糖苷酶，选择分子生物技术，将人参皂苷转化酶基因转入大肠杆菌中，获得更加大量表达的糖苷酶。
【发明内容】
[0004]本发明的目的提供一种制备人参皂苷compound K的方法，从朝鲜族传统发酵食品一一泡菜乳酸菌中分离转化稀有皂苷compound K糖苷酶基因，利用基因工程技术重组一种全新的β -葡萄糖苷酶，生物转化gypenoside XVII制备稀有人参阜苷compound K的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:
一种来自乳酸菌重组的β -葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法，包括下列步骤:
①构建泡菜乳酸菌基因组Fosmid文库；
②筛选产β-葡萄糖苷酶阳性克隆子；
③分离转化成稀有阜苷compoundK糖苷酶基因；
④PCR扩增推测的糖苷酶基因bgyl,纯化和限制性内切酶处理，与表达载体pMAL-c5X连接，转入到大肠杆菌后，经IPTG诱导过表达；
⑤研究重组酶Bgyl的特性；
⑥分析gypenosideXVII转化途径，与重组酶Bgyl反应生成稀有人参阜苷compound
Ko
[0006]进一步地，所述的糖苷酶基因是从朝鲜族传统发酵食品泡菜乳酸菌中分离转化稀有阜苷compound K糖苷酶基因bgyl。
[0007]进一步地，所述的IPTG诱导过表达:在37°C条件下，重组酶Bgyl在含有氨苄的LB液体培养基中培养，当菌密度(0D_)达到0.6时，加入浓度为0.2 mM IPTG进行诱导，并在20°C条件下培养10 h，使其在大肠杆菌BL21中过度表达。
[0008]进一步地，研究重组酶Bgyl的特性过程中，重组酶Bgyl的适宜温度在20°C -40°C之间，对酶的活性无明显影响，当温度高于40°C，酶的活性明显下降，当温度达到60°C时，酶完全失活。其中最适宜温度在30。。。pH为6.0，金属离子(Na\ K\ Mn2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+)对酶的活性无明显抑制作用。
[0009]进一步地，所述的分析gypenoside XVII转化途径过程中，来自绞股蓝中的Gypenoside XVII为转化底物。
[0010]进一步地，所述的分析gypenoside XVII转化途径过程中，转化途径:gypenosideXVII 一 gypenoside LXXV 一 compound K。
[0011]进一步地，所述的分析gypenoside XVII转化途径过程中，1.0 mg mL"1gypenoside XVII 与 0.1 mg mL"1 Bgyl 在 30°C、pH 6.0 条件下，6 h 内反应生成 0.58 mgmL"1 compound K，转化率为 89%。
[0012]本发明从泡菜乳酸菌中筛选葡萄糖苷酶的基因，利用基因工程技术对其进行重组，得到重组的葡萄糖苷酶，生物转化来自绞股蓝中gypenoside XVII从而实现稀有人参皂苷compound K的制备。本方法反应条件温和，时间短，对环境污染少，转化率高，可实现人参皂苷compound K的工业化生产，满足医疗保健等行业对人参皂苷compound K的需要。
【附图说明】
[0013]图1是知W的基因序列。
[0014]图2是gypenoside XVII转化的LC-MS检测结果，
其中，A是人参皂苷标准品，
B 是重组酶 Bgyl 与 gypenoside XVII 反应 0 h，
C 是重组酶 Bgyl 与 gypenoside XVII 反应 2 h，
D 是重组酶 Bgyl 与 gypenoside XVII 反应 6 h ；
1是人参皂苷Rbl，2是人参皂苷Rd，
3 是 gypenoside XVII，4 是人参阜 gypenoside LXXV。
[0015]图3 是 gypenoside XVII 转化的途径，
其中，a 是 gypenoside XVII，
b 是 gypenoside LXXV,c 是 compound K。
[0016]图4是研究重组酶Bgyl的特性PH选择反应。
[0017]图5是研究重组酶Bgyl的特性温度选择反应。
[0018]图6是研究重组酶Bgyl的热稳定性选择反应。
[0019]图7是研究重组酶Bgyl的特性金属离子对酶作用反应。
[0020]【具体实施方式】: 一种来自乳酸菌重组的β -葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法，包括下列步骤:
①构建泡菜乳酸菌基因组Fosmid文库:从从朝鲜族传统发酵食品泡菜乳酸菌中提取总DNA，脉冲场凝胶电泳分离基因组DNA，切割40 kb左右的DNA片段，经电洗脱后利用透析膜浓缩。浓缩后的DNA经末端修复后连接至载体pCClFOS?，利用包装蛋白包装成噬菌体微粒后转染至宿主菌EPI300-T1R。
[0021]②筛选产β -葡萄糖苷酶阳性克隆子:感染噬菌体的宿主菌EPI300-T1R涂布到含有氯霉素和X-Glu的LB平板培养基，被蓝色包围的区域即产β -葡萄糖苷酶阳性克隆子。
[0022]③分离转化成稀有皂苷compound K糖苷酶基因:挑取筛选的阳性克隆经诱导及液体培养后，和原人参二醇皂苷反应，通过TLC分析筛选转化人参皂苷的阳性克隆子。提取质粒后，使用载体PCC1F0S上自带的M13引物序列进行双末端测序，并进一步设计引物进行步移，直至序列测通。使用开放阅读框在线预测软件0RF finder (w