一种基于荧光共振能量转移技术的白三烯b4受体1拮抗剂药物筛选模型的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用细胞稳定转染和均相时间分辨巧光检测技术，构建 了白Ξ締Β4受体1括抗剂药物的筛选模型，用于待测样品对化Τι的括抗作用的高通量检 测。
【背景技术】
[0002] 白Ξ締Β4受体1 @LTi)是一种G蛋白偶联受体，在花生四締酸代谢途径中发挥着 重要作用。白Ξ締化T)通过激活化Τι在支气管哮喘、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化及多 发性硬化等疾病进程中发挥着重要的作用。
[0003]ΙΡ3是一种重要的第二信使，介导胞内Ca2+通道开放，增加胞内Ca2+浓度，引起生 理反应。胞内IP3是PIP2经PKC催化产生，PKC可在GPCRs与GTP结合蛋白Gaq相互作 用后而激活。运些G蛋白是由Ga，G0和G丫Ξ种亚基组成的异Ξ聚体分子。激动剂介导 的GPCRs激活可导致GTP结合上Gα亚基，引起构象改变，导致Ξ聚体解离成Gα和Gβ丫。 解离后，Gaq参与PKC的激活。ΙΡ3不稳定，在胞内逐步降解为ΙΡ2、ΙΡ1。ΙΡ1在LiCl存在 下可稳定存在。测量胞内IP1是检测待测化合物对于GPCRs介导的PKC激活作用的方法。
[0004] IP1assay是一种均相时间分辨巧光共振能量转移免疫分析方法，W检测在GPCRs 调控下PKC活性变化后产生的IP1。该方法基于d2标记的IP1示踪剂与样本IP1竞争结合 化穴状物标记的IP1特异性抗体的结合位点。当抗体结合了d2-IPl示踪剂，337nm处的 激光可激发化穴状物分子，其发出的能量被转移到示踪剂的d2分子上，而发出665nm的 巧光，在665nm处的巧光强度随着待测样品中的IP1含量的增多而减弱，因此信号强度与样 品中IP1浓度成反比。对于Gαq禪联的受体，细胞受到激动剂作用而激活会导致IP1水平 增加，同时665nm处的巧光强度减弱。加入括抗剂后该反应逆转，导致信号增强。
【发明内容】
阳005] 本发明的目的在于建立稳转细胞株白Ξ締受体化Τι括抗剂高通量筛选模型，具有 灵敏度高、步骤少、无损失、结果准确的特点。
[0006] 本发明的技术方案：确定稳转细胞株白Ξ締受体化Τι括抗剂药物筛选模型构建条 件，运用ΙΡ1assay免疫分析法验证激动剂对稳转细胞株化Τι受体的激动作用，W及括抗 剂对稳转细胞株化Τι受体的括抗作用。
[0007] 步骤一：白；締受体BLTi括抗剂筛选模型的建立与优化。 阳00引步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0009] 步骤Ξ:高通量筛选模型验证。
【附图说明】：
[0010] 图1 :IP1标准稀释液在Paradigm中的读值。（η= 3,x±s) W11]图2 :LTB4作用激动化Τι稳转细胞产生的量效曲线。（η= 3, ) 阳〇1引图3 :LY293111括抗BLTi稳转细胞产生的量效曲线。（η= 3, )
【具体实施方式】
[0013] W下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0014] 一、白Ξ締受体化Τι括抗剂筛选模型的建立 阳〇1引 1、实验材料
[0016] C册-Kl/Gal5/化11 细胞株、F12、10%FBS、2yL/mLHygromycin、Stimulation Buffer(SB)、C〇2培养箱、384 孔板、ParadigmΤΜDetectionPlatform。
[0017] 2、实验步骤
[0018] (1)细胞培养
[0019] 1)Τ25中培养的细胞贴壁度要达到80%，达到对数生长期。
[0020] 2)将贴壁细胞经邸ΤΑ消化、离屯、后重悬，对细胞计数。
[0021] 3)用培养基稀释细胞悬液，使细胞密度达到3Χl〇6cells/mU将此细胞悬液移入 T25培养瓶中，在37°C/5 %C〇2环境下培养细胞。
[0022] 4)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选化Τι括抗剂试验的CH0-K1细胞应是复苏 后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用 0. 5mM邸ΤΑ消化，离屯、，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。
[0023] (2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
[0024] 1)配制IP-one标准稀释液：P1标准溶液（试剂盒自带）逐级稀释为最终浓度的 2倍。 阳0巧]2)配制激动剂LTB4梯度稀释液：用化T1激动剂LTB4刺激细胞产生IP1，根据最终 拟合曲线得到的EC50和窗口值确定最佳细胞数。（见图1)。
[0026] 3)配制不同浓度的细胞稀释液：用IP1StimulationBuffer将（1). 4)中重悬好 的细胞分别稀释为 15000cells/μL20000cells/μL25000cells/μL。 阳027] 4)加样：a:将似.1)中稀释好的IPl溶液加入384白板中，每孔14μ1，；个复 孔；b:将（2). 2)中稀释好的LTB4溶液按每个浓度3个复孔，7μ1每孔加入384孔板中，接 着向其中分别加入（2).3)配制好的不同浓度的细胞稀释液7μ1。此时标准曲线和反应孔 反应体积均为14μ1。将TopSeal-A膜贴于板面并37°C解育比。
[0028] 5)终止试剂：用Lysisbuffer(LB)将IPl-d2 及anti-IPl稀释 33 倍，按 1 : 1 混 匀平衡室溫后加入各孔，每孔6μL。将384孔板在50化pm下离屯、5s，使20μL试剂混合均 匀W充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室溫下继续解育比。
[0029] 6)检测：解育时间到达后，掲去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm? DetectionPlat化rm上检测。处理数据，确定最佳细胞数和激动剂ET-1的ECs。和ECS。。（见 图2)
[0030] 做括抗剂验证
[0031] 1)配制化Τι括抗剂LY293111梯度稀释液：括抗剂LY293111母液浓度为4.6mM， 用IP1StimulationBuffer逐级稀释为终浓度的5倍。
[0032] 2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将（1). 4)中重悬好的细胞稀释为（2).6)中 得到的最佳细胞浓度（14000c