一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒。
【背景技术】
[0002] 不孕的医学定义为一年未采取任何避孕措施，性生活正常而没有成功妊娠。主要 分为原发不孕及继发不孕。原发不孕为从未受孕；继发不孕为曾经怀孕W后又不孕。根据 运种严格的定义，不孕是一种常见的问题，大约影响到至少10%~15%的育龄夫妇。引起 不孕的发病原因分为男性不孕和女性不孕。
[0003] 阳虚是阳虚证和阳虚体质的共同病理机制，其主要病机为体内阳气虚衰，W肢寒 身冷等寒象为主要表现。阳虚质是阳气不足、W虚寒现象为主要特征的体质状态。先天不 足，或病后阳亏，是形成阳虚质的主要原因。
[0004] 近年来研究发现不孕患者中阳虚质所占比例位居首位。女性阳虚质不孕症患者， 临床上多由肾气虚弱，经血不足，冲任失调；或胞宫虚寒，胞脉失养，运用中医专方治疗效果 较佳。
[0005] 但是，关于女性阳虚质不孕症的中医诊断和评价，目前均必须依赖于医生对患者 的访问，技术性强，对检测人员的专业要求高，而且工作量非常大。
[0006]testisin是一种糖基憐脂酷肌醇错定的丝氨酸蛋白酶，其在精子生成、附睾精子 成熟和受精中起重要作用。
[0007] 未见testisin与阳虚不孕之间的关系的报道。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述问题，本发明提供了一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒。
[0009] 本发明女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测testisin基因 表达水平的试剂。
[0010] 优选地，所述试剂是用于检测血清中testisin基因表达水平的试剂。
[0011] 优选地，所述testisin基因的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0012] testisin基因的核巧酸序列如下：
[0013]
[0014]
[0015] 优选地，所述检测testisin基因表达水平的试剂时Ncxrthern-blot检测方法用试 剂、RT-PCR检测方法用试剂或原位杂交检测方法用试剂。进一步优选地，所述RT-PCR检测 方法用试剂包括SEQIDN0:2~3所示的引物对。
[0016] 本发明还提供了检测testisin基因表达水平的试剂在制备女性阳虚质不孕症筛 查用试剂中的用途。
[0017] 优选地，所述试剂是用于检测血清中testisin基因表达水平的试剂。
[0018] 优选地，所述testisin基因的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0019] 优选地，所述检测testisin基因表达水平的试剂时Ncxrthern-blot检测方法用试 剂、RT-PCR检测方法用试剂或原位杂交检测方法用试剂。进一步优选地，所述RT-PCR检测 方法用试剂包括SEQIDN0:2~3所示的引物对。
[0020] 本发明试剂盒通过检测testisin基因的表达水平，可W判断待检人群患女性阳 虚质不孕症的风险：若testisin基因的表达水平高，则患女性阳虚质不孕症的风险低，若 testisin基因的表达水平低，则患女性阳虚质不孕症的风险高，可用于临床女性阳虚质不 孕症的辅助诊断，临床应用前景良好。
[0021] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0022] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1testisin基因的表达水平与女性阳虚质不孕症的关系
[0024] 1.材料与方法 [00巧]1. 1实验材料
[0026] 1. 1. 1主要实验仪器
[0027]定量PCR仪 MJResearch,PTC-200
[0028] 紫外分光光度仪 BECKMAN
[0029]C1000ThermalCyclerBIO-RAD
[0030] 1. 1. 2主要实验材料与试剂
[0031]
[0032] 1. 1. 3试剂配制：
[003引（l)PBS缓冲液（g/l，000血）：
[0034]
[0035] 加入DEPC处理的RNase-Free的水，抑值为7. 3左右，定容至1000血，高压灭菌。
[0036] 似红细胞裂解液：
[0037]
[0038] 加入DEPC处理的RNase-Free的水，定容至1000血，过滤除菌。
[0039] (3)血液抗凝剂：10μL0. 5M邸TA/ml血液
[0040] 1. 2临床资料
[0041] 1.2. 1对象来源
[0042] 来源于2013年12月~2015年1月于成都中医药大学第二附属医院口诊，选取典 型女性阳虚质不孕患者为研究对象，选取典型平和体质正常健康人为对照组。
[0043] 1. 2. 2不孕的诊断标准（参照第屯版全国高等学校教材《妇产科学》）
[0044] 婚后夫妇同居一年W上，有正常性生活，男方生殖功能正常，未避孕而未能受孕者 称为不孕症。婚后未避孕而从未妊娠者，称为原发不孕。曾经妊娠，而后未避孕连续一年未 再妊娠者，称为继发不孕。
[0045] 1. 2. 3中医体质类型分类标准（参照中华中医药学会《中医体质分类与判定》）
[0046] 阳虚质：
[0047] 主项：平素畏冷，手足不溫，喜热饮食，精神不振，睡眠偏多。
[0048] 副项：面色既白，目胞晦暗，口唇色淡，毛发易落，易出汗，大便漉薄，小便清长，舌 淡胖嫩，边有齿痕，苔润，脉象沉迟。
[004引平和质：
[0050] 主项：阴阳气血调和，W体态适中、面色红润、精力充沛等。
[0051] 副项：面色、肤色润泽，头发稠密有光泽，目光有神，鼻色明润，嗅觉通利，唇色红 润，不宜疲劳，精力充沛，耐受寒热，睡眠良好，胃纳佳，二便正常，舌色淡红，苔薄白，脉和缓 有力。
[0052] 1. 2. 4纳入标准
[0053] (1)年龄21~49岁的育龄期女性；
[0054] 似自愿参加实验，签署知情同意书。
[00巧]1. 2. 5排除标准
[0056] (1)合并有肝、肾、屯、血管和造血系统等严重原发性疾病者；
[0057] 似有严重视听和语言障碍，可能影响对调查问卷的正确理解和回答者；
[0058] (3)严重精神病患者。
[0059] 1.2. 6剔除标准
[0060] (1)不符合纳入标准或符合排除标准者；
[0061] (2)未按规定完整填写调查表者。
[0062] 1. 2. 7 -般资料分析
[006引 （1)病例分布情况
[0064] 本实验共纳入受试者28例，最终进入评价的受试者28例：病例组22例，对照组6 例。
[0065] (2)两组患者基本资料
[0066] 表1对照组体质类型
[0067]
[0068] 表2阳虚组体质类型
[0069]
[0070] 1. 3实验方法
[0071] 1. 3. 1中医体质评定标准
[0072] 依据最新2009版中华中医药学会《中医体质分类与判定》标准进行体质筛选。阳 虚体质诊断标准为：阳虚亚量表转化分> 40分，且平和质亚量表中转化分<60分；平和体 质诊断标准为：平和质亚量表中转化分> 60分，且阳虚及其他偏颇体质亚量表转化分<40 分。具体量表见附录1。
[0073] 1. 3. 2qRT-PCR技术检测testisin基因的研究
[0074] (1)样品制备
[00巧]抽取每例患者新鲜邸TA抗凝血2ml，400-500g离屯、5min，弃上清；
[0076] 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室溫放置4-5min;
[0077] 4°C，400-500g离屯、5min，弃上清；
[007引重复b)和c)
[0079] 洗涂1-2次：加入适量PBS,重悬沉淀，400-500g离屯、3min，弃上清；
[0080]加入 200μLTrizol。
[0081] 似提取RNA，合成cDNA [008引①提取RNA
[0083] 在分离出的每一管细胞中加入200μLTRIZOL用枪头吹打使细胞全部脱离板底， 将其转入1. 5mL化管中；
[0084] 用5mL带7号针头的1次性注射器快速吹打10次进行匀浆W剪切基因组DNA，将 匀浆样品在室溫解育5minW使核蛋白体完全分解；
[0085] 加40μL氯仿，盖紧化管盖，用手剧烈振荡15s并于室溫解育2-3min;
[0086] 4°C，12, 000Xg离屯、15min。离屯、后混合物分成3层：下层红色的为苯酪-氯仿 层，中间层为细胞残渣，