基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[000。 本发明属于基因突变检测领域，尤其设及利用Sanger测序灵敏检测人类EGFR基 因突变的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]人类表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)是一种由原 癌基因C-erbB-1 (肥R-1)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正 常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤巧日非小细胞肺癌)中往往存在EGFR高表达或异常表达 的情况，运与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及调亡的抑制有关，因此EGFR已经成 为相关肿瘤(尤其是非小细胞肺癌）祀向治疗的一个重要祀点。目前应用于临床的EGFR祀 向药物包括：EGH?酪氨酸激酶抑制剂（TKIs，如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯）， W及EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明，吉非替尼（Gefitinib)和厄罗替尼 (化lotinib)的疗效与EGFR基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带EGFR 基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型 基因的患者将基本不受益，因此EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等癌症祀向药物选用的 前提被列入了最新的NCCN(美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。
[000引 目前报导的EGFR基因突变检测方法包括Sanger测序、SCO巧ions-ARMS、TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等，其中在临床和科研中较为常用的方法为Sanger 测序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蜗形探针；Amplificationrefractorymutation system,扩增阻滞突变系统）法。基于Sco巧ions-ARMS法开发的如德国Qiagen公司的 EGFR检测试剂盒，可同时检测EGFR基因的29种常见突变，具有灵敏度高(可测出低至1% 水平的突变)，操作简单，快速检测等优点；然而该类进口试剂盒检测成本过高(每份标本需 3000-5000元）限制了其临床的推广和应用。Sanger测序法是基因突变/多样性检测的金 标准，具有技术和平台成熟、结果准确和全面等优点，相比于SCO巧ions-ARMS法，检测费用 低廉并且还能测出未知突变；然而Sanger测序法主要的不足在于检测灵敏度约10-20%左 右（即突变基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠检出），运制约了其临床应用。由于体 细胞突变组分只占临床等样本中的一部分，除此之外还可能存在大量的野生型基因，因此 提高在大量正常基因背景中少量突变检测的灵敏性，是目前改进或者开发方法的关键。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法及试剂盒的不足，本发明的目的之一 在于提供一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒；本发明的另一个目 的在于提供一种基于Sanger测序的灵敏检测人类EGFR基因突变的方法。
[0005] 由于本发明在EGFR基因特定片段的扩增体系中加入了耐热DNA连接酶和针对突 变位点的连接引物，导致样品中的野生型EGFR基因片段的扩增将受到有效的抑制，而突变 型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片 段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 本发明首先设及一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的引物，所述引物 由扩增引物组和连接引物组组成，所述连接引物组的核巧酸序列如SEQ.IDNO. 9-SE化ID NO. 26所示。
[0007] 其次，本发明的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，是在EGFR 基因片段扩增体系中加入了所述的连接引物组、耐热DM连接酶及其缓冲液。
[0008] 更具体地，基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，具体 步骤和本发明试剂盒相关内容如下： (1)样本采集和基因组DNA提取 采集或取出待测生物样本如患者的肿瘤组织或外周血等，利用相应的试剂盒提取其基 因组DNA。
[0009] (2)EGFR基因特定片段扩增 采用本发明试剂盒分别配制EGFR基因外显子组合的含连接酶扩增体系，一共需要配 制5管；所配制的5管扩增体系除了扩增引物和连接引物不同外其余均相同，如表1所示： 表1EGFR基因外显子扩增体系（2加L)
同时配制对应的不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶运Ξ种组分 的对照扩增体系5管，体系配制参照表1，所缺组分添加量由灭菌去离子水替补，其余组份 同对应的正常体系。
[0010] 共5管正常体系冷连接酶体系）和5管对照体系坏含连接酶体系）在基因扩增 仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95°C预变性5-lOmin;94°C变性15-30S， 50-53°C退火 45-90s，72°C延伸l-2min，循环 30-36 次；72°C终延伸 10-12min。
[0011] (3)目的基因片段的割胶回收 所有的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0.加g/ml的邸溶液中染色20min并用清水 脱色后置于凝胶成像系统上拍照和分析。在对照体系成功扩增出目的基因片段的情况下， WDNAMarker条带为标准，选择正常体系中各外显子扩增产物浓度不低于lOng/uL的条带 进行割胶，并用凝胶纯化试剂盒进行回收。
[0012] (4)目的基因片段序列测定 对于割胶回收产物，按照DNA片段测序的标准操作进行双向测序和分析，依据所有测 序峰图最终分析目的基因片段的序列。
[001引（5)EGFR突变结果判定 在对照体系正常扩增的情况下，如果正常体系中的各外显子扩增条带均无满足割胶回 收的目的条带，则无需进行割胶回收及后续操作直接判定样品的EGFR基因检测结果为阴 性即野生型；如果有满足割胶回收的目的条带，且双向测序结果显示为对应连接引物祀向 的已知突变，则判定样品的EGFR基因检测结果为阳性即突变型，突变类型W实际测出的已 知突变为准；如果双向测序结果均为同一未知差异位点，则需进一步判定样品的EGFR基因 检测结果为新突变还是多态性，突变/多态性类型W实际测出的为准；如果双向测序结果 均为野生型，则判定样品的EGFR基因检测结果为无法判断，需要重新测定；如果双向测序 结果是一向为野生型一向为突变型，则判定样品的EGFR基因检测结果为无法判断，需要重 新测定。
[0014] 其中，步骤（1)中样本的采集对象若为肿瘤患者则应在其充分知情同意的前提下 进行；采集或取出的组织样本包括但不限定于新鲜组织、冰冻组织、甲醒浸泡组织和甲醒固 定石蜡包埋组织切片，血液样本包括但不限定于新鲜血液、血浆和血清，其它生物样本包括 但不限定于胸水、腹水和肿瘤脱落细胞，样本采集或取用量等取样要求和前处理按照对应 的基因组提取试剂盒执行；提取样本基因组DNA后，利用琼脂糖凝胶电泳或吸亮度法评估 其提取量(浓度）和纯度，需要保证EGFR基因片段的有效扩增：如基因组DNA的提取量不少 于200ng，纯度W0〇2日。/0〇28。在1. 8-2. 0之间为宜。
[0015] 其中，步骤（2)中采用的扩增试剂盒组分如表2所示： 表2本发明扩增试剂盒组分
表2组分中，DNA聚合酶的酶活力单位浓度为抓/祉，具有耐热性能；10XPCR缓冲液 是由lOOmmol/LTris-肥 1 (pH=8. 3)、500mmol/LKC1 和 15mmol/LMgClz组成；dNTPs是由 dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2. 5mmol/L混合而成的；对应于EGFR基因的第18、19、20和21 号外显子，每个外显子各自都有一对扩增引物