检测植烟土壤黑胫病菌定殖量的锁核苷酸增敏实时荧光定量pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体设及一种检测植烟±壤黑腔病菌定殖量的锁核 巧酸增敏实时巧光定量PCR检测方法，适用于各种植烟±壤中的烟草黑腔病菌抱子数量的 定量检测。
【背景技术】
[0002] 烟草黑腔病是一种毁灭性±传真菌病害。有报导表明在我国烟草黑腔病平均发病 率为10 %~20%，发病率高的田块高达75 %该叫尧霞等，2004)，较为严重的甚至造成绝收 (陈瑞泰等，1997 ;苏德成，1992)。我国每年烟草因黑腔病引起的损失超过2亿元(赵振山， 2005)，烟草黑腔病（Tobaccoblackshank)是疫霉菌烟草变种引起的一种±传病害，其中 受±壤环境和栽培措施影响较大，在河南、山东和安徽、云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、 福建等烟区发生。
[0003]W前较为传统的植物病害诊断方法常根据病组织的症状和病原菌的特征进行，但 是效率较低且耗时较多。近年来血清学和核酸技术的应用，为植物病原的快速检测提供了 不少新技术。有人采用RFLPs技术对邱.jOisi的3个生理小种进行研究，差 异明显（Coddington，1992)。Kistle;r(1989)等人对mtDNAs的差异进行分析，能够区别出 尖镶抱巧wariiM? 〇巧巧οατω?的不同转化型；谢勇等根据从GeneBank数据库获得的引起黑 腔病的疫霉属真菌rDNAITS区段序列，合成了 1对17bpDNA特异引物进行了不同病原菌、 病组织及±壤中寄生疫霉菌rar.nico化Mae)的特异扩增试验，包I制了一套 快速检测的PCR方法。目前的检测方法灵敏度较低，研制敏感性更高的烟草黑腔病菌检测 方法是当务之急。
[0004] 锁核酸化ockednucleicacid,LNA)是一种近年来开始被人们关注的新型的寡 核酸衍生物，在药学研究方面引起了人们的广泛关注，有望成为分子治疗一些疾病如癌症 的突破口。其结构中B-D-巧喃核糖的2-0，4-C位通过缩水作用构成环形的氧亚甲基桥、 硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，巧喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结 构。L环形桥锁定了巧喃糖的N构型，降低核糖结构的柔初性，增加憐酸盐骨架的稳定 性。在寡核巧酸中加入锁（LNA)修饰碱基可显著增强寡核巧酸与DNA的结合能力；含有 LNA修饰的碱基的引物已经广泛应用于巧光PCR反应体系。但目前尚未发现此类技术应用 于烟草黑腔病菌在植烟±壤中的检测方面。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是基上述现有状况提供了一种LNA增敏的植烟±壤黑腔病菌抱 子数量的巧光定量PCR检测方法。
[0006] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的： 一种检测烟草黑腔病菌在植烟±壤中定殖数量的方法，包括如下步骤， (1) W黑腔病菌数量对数值为X轴，巧光PCR扩增仪读出的Ct值为Υ轴，绘制数量对数 与Ct值的标准曲线： 巧采用LNA增敏的定量PCR方法将烟草黑腔病菌特异区DNA进行扩增，当扩增出基因 片段为25化P时，即得到烟草黑腔病菌特异区DNA; 潭将黑腔病菌特异区DNA插入到感受态大肠杆菌载体PMD18-T载体后，接种到含有氨 节青霉素的LB培养基中，氨节青霉素在LB培养基中的质量浓度为l(K)ng/mL;培养24h后 采用质粒试剂盒（TAKARA公司）制备烟草黑腔病菌特异区DNA质粒(制备过程按照该公司 提供的说明书）； 霸将奠步制备好的质粒经紫外分光光度计A26〇定量，测得质粒母液质量浓度，然后用 灭菌后的超纯水稀释，得到母液逐级稀释液； i将步得到的逐级稀释液，采用巧光定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出 25化Ρ产物时，记录该Ct值，W每级稀释液拷贝数对数值为X轴，CT值为Υ轴，即绘制出拷 贝数与Ct值得标准曲线； (2) 从烟区进行感染黑腔病烟株附近±壤的取样后，提取DNA; (3) 采用LNA增敏的巧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为 25化P的产物时，记录此时待测DNA的Ct值，将该Ct值带入到步骤（1)绘制出的标准曲线 当中，得到PCR反应体系中黑腔病菌拷贝数，根据如下公式计算出黑腔病菌在±壤中的定 殖数量； Copies=CpcRX (Vd,a/Vpcr) X (1/Wext) Cptf为PCR反应得到的黑腔病菌数量，VwA为植烟上壤提取DM得到的最终溶解量，VPC,为定量PCR的加样量，WexT为提取DM所使用的植烟±壤重量。
[0007] 所述步骤（1)和步骤（3)中巧光定量PCR扩增方法中所用的试剂包括12. 5μ1 的2Χ巧光定量PCR反应混合液(购买于罗氏公司），浓度均为lOumol/L的正向引物、反向 引物各1μ1，lul的黑腔病菌特异区DNA质粒溶液或待测黑腔病菌DNA溶液，超纯水补至 25μ1〇
[000引所述的LNA修饰的正向引物和反向引物的序列如下：正向引物为： 5'-TGAACGCATA王TGCACTTCC-3'；反向引物：5' -GACAAACCAGTCGCCAATTT-3'；LNA修饰位点W 下划线表示。
[0009] 所述的步骤（1)和步骤（3)的反应条件为95°C热启动8分钟预变性后；进入扩增 循环：95°C30秒，60°C10秒，72°C20秒循环45次。
[0010] 本发明的重要效果是，通过对烟草黑腔病菌特异区域DNA进行引物设计，能够准 确地单一检测出黑腔病菌的定殖量，而且采用的LNA增敏的巧光定量PCR扩增方法，黑腔病 菌在每个拷贝数量级上都有相应的Ct值，该PCR检测方法高效省时，操作方便快捷。
[0011] 本发明W5.8SribosomalRNA及其相邻的口S区域片段为目标检测序列，采 用LNA技术合成覆盖目标片段的引物序列，结合定量核酸扩增技术，建立了一种锁核巧酸 (LNA)增敏的烟草黑腔病菌实时巧光定量PCR检测方法。
[0012] 本发明的锁核巧酸（LNA)增敏的烟草黑腔病菌实时巧光定量PCR检测方法适用于 各种植烟±壤中的黑腔病菌定殖量的定量检测，且具有W下优势： 劈灵敏度较高配置好的标准品为例，检测阔值可W达到10个拷贝/μ1。
[0013] 變检测时间短，从植烟±壤DM的提取到结果获得，可在4~5小时之内完成。
[0014] 锡本发明的方法对模板DNA的要求较低，无论是沙质±，壤±、红±等都能取得较 好的检测结果。
[001引囊定量PCR检测的样本量较大，在4~5小时内最多可W检测384例。
[0016] 鬻本发明建立的锁核巧酸（LNA)增敏的烟草黑腔病菌实时巧光定量PCR检测方 法，具有较高的检测灵敏度，对于上壤中极微量的黑腔病菌定殖量的检测能够起到极大的 促进作用。
【附图说明】
[0017] 图1、PCR反应中不同溫度梯度对LNAPCR扩增的影响； 图 1 中：Μ为DL500marker,泳道 1~7 分别为 55 °C、55. 8 °C、57. 4 °C、59. 7 °C、62. 6 °C、65 °C、66. 3°C的退火溫度下菌丝DM扩增产物的电泳结果，泳道8为阴性对照。
[001引 图2、普通DNA引物和LNA引物在不同退火溫度下的PCR扩增产物的电泳图像； 图2中：Μ为化500marker, 1为LNA引物的阴性对照，2为普通DNA引物的阴性对照，L1~L7 和D1~D7 分别为LNA引物和DNA引物在 55°C、55. 8°C、57. 4°C、59. 7°C、62. 6°C、65°C、 66. 3°C退火溫度下的PCR扩增结果。
[0019] 图3、含有5. 8SribosomalRNA及其相邻的口S区域片段质粒的10倍稀释液的 扩增曲线； 图3中：曲线1~5表示黑腔病菌质粒浓度分别为1.0Xl〇6，1.0Xl〇5，l.〇Xl〇4，1.0X103，1.0X102个/μl。
[0020] 图4、根据含有5. 8SribosomalRNA及其相邻的口S区域片段质粒的10倍稀释 液定量PCR扩增结果构建的标准曲线图。
[0021] 图5、植烟±壤DNA定量PCR扩增的扩增曲线图。
[002引图6、植烟±壤DNA定量PCR扩增的溶解曲线图。
【具体实施方式】
[0023] W下结合【具体实施方式】对本
【发明内容】
做进一步的说明。
[0024] 实施例1、±壤取样与±壤DNA的提取 选取黑腔病发病较重的田块，在感染黑腔病烟株靠近根茎结合部附近取样2~3克± 壤，将其装入50ml离屯、管W备DNA提取使用。
[00巧]实验中对植烟±壤0臟的提取采用美国M0BI0公司的P0WERS0ILDNAisolation kit(专口用于提取DNA的试剂盒），提取方法如下：将0. 25g