一种快速检测鲤疱疹病毒iii型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及鱼类病毒的快速检测方法，具体设及一种快速检测經瘤疹病毒III型 的方法，尤其是采用非致死性方法采集样品后提取DNA进行LAMP反应检测的方法。
【背景技术】
[0002] 锦經瘤疹病毒病化oiHe巧esvirusDisease,KHVD)是由锦經瘤疹病毒化oi 化rpesvirus，KHV)感染引起經鱼、锦經W及普通变种觸坏死、间质性肾炎的一种高致病 性，高传染性，高死亡率的疾病。该病发病率高、流行范围广，致死率高达80%-100%。自 1998年W来，KHVD在世界范围内许多經鱼和锦經养殖场发生，死亡率极高，该病的爆发给 經鱼和锦經养殖业造成了严重的经济损失。KHVD是0IE(Worldorganization化ranimal health)和中国农业部必须要求上报的II类动物疫病 阳00引目前KHV的检测诊断方法有细胞分离法、电镜观察法、中和实验、ELISA、PCR、组织 病理学观察。聚合酶链式反应（PCR)和细胞培养技术是0IE推荐的诊断方法。《一种锦經 瘤疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法》中采用的是致死性采样方法，采样步骤繁琐，不适用 于活体检测价值昂贵的观赏性锦經，并且LAMP扩增反应液的添加复杂，易发生污染，在野 外临床检测中存在各种限制，比如仪器、技术等方面。
[0004] 因此需要设计一种新的快速检测經瘤疹病毒III型的方法，W解决现有技术的问 题。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，设计一种快速检测經瘤疹病毒III型 的方法，在引物设计方面选取了特异性和稳定性很高的Sphi区域作为目的条带设计引物； 使用非致死性的拭子采样，操作快速简单；采用了快速DNA提取方法，只需煮沸组织样，静 置冷却取上清即可完成，具有快速、简便的特点；引入一对环状引物，进一步缩短了反应时 间；反应体系由LAMPmix和模板DNA两部分组成，操作简单，减少了假阳性；具有极高的检 测准确性和效率，不会对采样活体带来伤害，具有极佳的应用前景。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种快速检测經瘤疹病毒III型的 方法，所述方法通过设计經瘤疹病毒III型Sphi基因编码区域的特异性扩增引物，采用非 致死性方法对經鱼采样后提取样品DNA进行LAMP反应，通过对扩增产物的检测，从而确定 样品中是否存在經瘤疹病毒III型。
[0007] 优选的，特异性扩增引物包括W下引物：
[0008] (1)上游内部引物（ForwardInnerPrimer,FIFO:
[0009] 5 ^ -GCTGTGGTAGGTGTTGCTGAGATTTTCACCACATCTGCAAGGAGT-3 ^
[0010] (2)上游外部引物（ForwardOuterPrimer,F3):
[0011] 5 > -GCTGTTTGCCTGCAGGAA-3' 阳01引（3)下游内部引物度ackwardInnerPrimer,BIF〇 :
[0013] 5> -GAGCATCGTGGGGTTCCAGACTTTTAGGCTCTTGTAGCGGTCC-3>
[0014] (4)下游外部引物度ackward Outer Primer, B3):
[0015] 5' -TGAACGACTGCGACTGTTG-3'
[0016] (5)上游环引物（Forwar化OOP Primer, LF):
[0017] 5' -CAGCTTGTTCGAGC-3'
[0018] (6)下游环引物度ackwar化OOPPrimer，LB):
[0019] 5，-ATGGACCTCGCATACGC-3，。
[0020] 优选的，提取样品DM中采用的DM提取液包含W下成分：
[0021] lOmmol · L iTris-肥1，Immol · L ^DTA, ISmmol · L i氯化钢，0. 5% SDS，pH 8. 0。 阳02引优选的，LAMP扩增体系中，每25ul的LAMP扩增体系包含W下成分：
[0023] 23ul LAMP mix, 2ul模板DNA ;
[0024] 其中23ulLAMPmix包含：ΙμΙ上游外部引物Ρ3(1〇μΜ)，1μΙ下游外部引物 Β3 (10μΜ)，1μL上游内部引物FIP(50μΜ)，1μL下游内部引物ΒΙΡ(50μΜ)，luL下游 环引物LB(25uM)，luL上游环引物LF(25uM)，3. 5μLdNTPs(25mM)，3μL10XThermopol buffer, 8UBstDM聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgClz(25mM)和2. 5μLd地2〇; 阳0巧]其中IXThermopolbuffer反应缓冲液包含：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2S〇4、10mM KCl、2mMΜ拆〇4、0. 1%TritonX-100(p册.8,25°C)。
[00%] 进一步优选的，该方法的步骤为：
[0027](1)非致死性样品采集：
[0028] 使用采样拭子或医用棉签采取經鱼两侧觸部的黏液，将采完病料的拭子或棉签置 于保存管中保存备用；
[0029] 似样品DNA的提取：
[0030] 取50ul裂解液于1. 5m化P管中，将采样后的拭子或棉签置于其中揽动Imin，煮沸 10分钟后室溫静置5分钟，取上清液于-2(TC保存备用；
[0031] 或者用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于30 μ L灭菌水， 于-20°C保存备用；
[0032](3)环介导等溫扩增LAMP :
[0033]采用25ul反应体系：23ul LAMPmix和2 μ L模板DNA ;
[0034] 反应程序为：64°C解育60min，80°C用灭活酶处理5min终止反应；
[0035] (4)检测结果判定：检测步骤（3)制备的反应产物，如果存在环介导等溫扩增产物 则说明待检测鱼中有經瘤疹病毒III型。
[0036] 优选的，检测结果判定的方式为：发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦憐酸根离子 和反应液中儀离子形成白色焦憐酸儀沉淀，通过肉眼判断：检测管中出现明显浑浊为阳性， 未见浑浊为阴性。 W37]可选的，检测结果判定的方式为：每25ul体系的反应管中加入lOOOxSYBR Green I 1~4ul，反应1~5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持澄色为阴性。
[0038] 可选的，检测结果判定的方式为：扩增产物用1% (w/v)的琼脂凝胶电泳后，置于 凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，贝U结果为阴性。
[0039]优选的，设计特异性扩增引物是根据GenBank公布的KHV美国毒株（KHV-U，ID:DQ65794S.1)、W色列毒株（KHV-I，ID:DQl7734e.1)和欧洲毒株（KHV-GZ11， ID:KJ627438. 1)的Sphi基因编码区（0RF54)共有序列进行引物设计；应用 PrimerE邱lorerV4在线软件设计特异性扩增引物。 W40] 本发明的优点和有益效果在于：
[0041] 快速检测經瘤疹病毒III型的方法与现有技术相比，具有W下优点：
[0042] 1、在引物设计方面选取了特异性和稳定性很高的Sphi区域作为目的条带设计引 物，提高了检测的准确性和效率；
[0043] 2、在采样上使用了拭子和棉签采样（非致死性采样），操作快速简单，也适用于昂 贵的观赏性锦經的活体检测；
[0044] 3、在模板DNA提取方面，采用了快速DNA提取方法，只需煮沸组织样，静置冷却取 上清即可完成，具有快速、简便的特点；
[0045] 4、一种快速检测經瘤疹病毒III型的方法引入一对环状引物的改进方法，进一步 缩短了反应时间；
[0046] 5、反应体系由LAMPmix和模板DNA两部分组成，操作简单，减少了假阳性。
【附图说明】
[0047]图1是一种快速检测經瘤疹病毒III型的方法特异性检测结果的示意图。
[0048] 图2是一种快速检测經瘤疹病毒III型的方法Ξ个月后的LAMP mix体系稳定性 检测结果的示意图。
[0049] 图3是一种快速检测經瘤疹病毒III型的方法灵敏度检测结果的示意图。
[0050] 图4是一种快速检测經瘤疹病毒III型的方法不同加热方式对LAMP扩增效果试 验的不意图。
[0051] 图5为实施例8中采样的具有临床症状的經鱼和锦經的照片。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步描述。W下实施例仅 用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能W此来限制本发明的保护范围。
[005引实施例1 :采用非致死性法采样：
[0054] 将样本的鱼置于解剖盘上，使用綴子将觸盖打开，同时使用拭子或棉签采取左右 两侧觸部的粘液，当拭子或棉签不能再继续采集粘液即可。