一种用于初级纤毛相关疾病致病基因筛查的基因芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因诊断领域，设及一种基因忍片，具体设及一种用于初级纤毛相关 疾病致病基因筛查的基因忍片及其应用。
【背景技术】
[0002] 初级纤毛相关疾病是一组临床表型和基因型相互重叠的疾病，其病因在于初级纤 毛缺陷。纤毛相关疾病设及人体多种器官比如肾脏、脑部、四肢、眼部、耳、肝脏、骨骼等。 其表型包括多囊肾、肝胆疾病、多指/趾、认知障碍、视网膜退化、骨骼异常、肥胖、内脏转 位等。初级纤毛相关疾病包括：Bardet-Biedl综合症度BS)、青少年消耗性肾病（NPHP)、 Senior-Loken综合症（SLN巧、Alstrom综合症（ALM巧、Meckel-Grubber综合症（MK巧、 Joubed综合症（JBTS)、1型口面指综合症（0FD1)、埃利伟氏综合症巧VC)及先天性利伯氏 黑朦0XA)、多囊肾病（PKD)等。
[0003] 比较基因组学和蛋白质组学分析指出：纤毛上存在超过1400种多肤，仅纤毛轴丝 上的被识别蛋白就可达200种。因此，相关基因的异常将破坏初级纤毛的组装、解聚的平衡 过程，或是直接影响其信号通路，阻断其传导、感受功能，导致初级纤毛异常，出现多种发育 和细胞信息缺陷，从而产生初级纤毛疾病。
[0004]目前来说，初级纤毛疾病尚无可靠而确切的治疗方法，其诊断仍然依赖临床表型， 考虑到其临床表型的复杂性，单纯的表型诊断会带来一定的干扰。新一代测序技术（NG巧 是近年来兴起的一种能够省时有效的识别疾病致病基因的手段，NGS针对的是经过严格筛 选的相关候选基因。基于基因忍片外显子捕获和NGS的基因诊断平台可W同时检测成百上 千个基因，使得基因检测变得相对简单和快速。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于初级纤毛 相关疾病致病基因筛查的基因忍片。本发明的基因忍片操作步骤简单，检测特异性高，稳定 性好，时间短，成本低。
[0006] 本发明的目的之二在于提供了上述基因忍片的用途。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采取了W下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种用于初级纤毛相关疾病致病基因筛查的基因忍片，所述基因忍 片包括固相载体和固定于所述固相载体上的探针；所述探针序列如SEQIDNO. 1-113所示。
[0009]所述探针可W被修饰，修饰方法可W是5'-N肥修饰、5甜修饰、5'-PolyT(A、C或G)修饰、5'-生物素修饰、3' -N肥修饰、3甜修饰、3'-PolyΤ(A、C或G)修饰和3'-生 物素修饰等。
[0010] 本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与反应物相容，不 会影响检测结果就可W。优选地，所述固相载体选自载玻片、娃片、膜或高分子材料中的任 意一种。优选地，所述膜选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙締膜中的任意一种。
[0011] 忍片制备方法主要包括两种类型：（1)点样法：首先是探针库的制备，根据基因 忍片的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡 核巧酸序列，然后通过计算机控制的Ξ坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同 的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙W及其它固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学 的方法使之固定，该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自 行制备点阵规模适中的基因忍片。（2)原位合成法：该法是在玻璃等硬质表面上直接合 成寡核巧酸探针阵列，目前应用的主要有光去保护并行合成法，压电打印合成法等，其关 键所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可W为探针形成双链的部分提供一 个自由的空间W减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[AfanassievV,HanemannV,Wolfl S.PreparationofDNAandproteinmicroarraysonglassslidescoatedwithan agarosefilm.NucleicAcidsRes. 2000, 28:e66;USAPatentNo. 5556752]。连接臂越长， 杂交效率越高。典型的连接臂包括15-30个功能基团长度。连接臂可W选用适当形式的功 能基团，如化lyT(A、C或G)、C原子或聚乙締乙二醇与化lyT(A、C或G)的嵌合体、聚乙 醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA 化学合成技术，适合制作大规模DNA探针忍片，实现探针忍片的标准化和规模化生产。
[0012] 进一步，本发明的基因忍片的制备使用原位合成法。本领域技术人员熟知利用原 位合成法制备基因忍片的步骤，可W利用常规的技术手段完成本发明的基因忍片的制备。
[0013] 本发明还提供了上述基因忍片的使用方法，包括W下步骤：
[0014] (a)制备样品DNA片段；
[001引化）巧光标记上述DNA片段；
[0016] (C)洗脱上述标记产物；
[0017] (d)将标记产物与所述基因忍片杂交；
[0018] (e)扫描检测基因忍片的杂交信号，获得结果。
[0019] 所述样品DNA片段制备可包括扩增的步骤，用分离的祀样本中含核酸的细胞直接 扩增，也可用抽提的祀核酸直接扩增。如用磁珠从全血中分离白细胞，直接用分离的白细胞 或用全血抽提的核酸作模板，扩增目的核酸序列。扩增得到的DNA可含有巧光或生物素标 记，标记的DNA可不经纯化直接用于杂交。
[0020] 样品DNA片段可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应 (polymerasechainreaction，PCR)，多重PCR，连接酉每链反应（ligasechainreaction， LCR)，滚环扩增（rollingcycleamplification,RCA),基于核酸序列的扩增（nucleic acidsequence-basedamplification,NASBA),链置换扩增(stranddisplacement amplification，SDA)和转录介导的扩增（transcriptionmedicatedamplification，TMA) 等。
[0021] 所述探针或样本DNA都适合用于标记。探针在合成引入标记，样本DNA可W在扩 增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。
[0022] 合适的标记包括巧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素 或有特殊结合配体的配基。
[0023] 本发明还提供了一种用于初级纤毛相关疾病致病基因筛查的工具。所述工具包括 前面所述的基因忍片。优选地，所述工具是试剂盒。
[0024] 进一步，上述筛查试剂盒除了包含前面所述的基因忍片之外，还可包含提取DM 的试剂、标记DM的试剂、洗脱和纯化DM的试剂等用于基因忍片检测过程中的试剂。
[00巧]本发明还提供了上述基因忍片在制备初级纤毛相关疾病致病基因筛查工具中的 应用。所述工具包括前面所述的基因忍片。优选地，所述工具是试剂盒。进一步，上述筛查 试剂盒除了包含前面所述的基因忍片之外，还可包含提取DNA的试剂、标记DNA的试剂、洗 脱和纯化DNA的试剂等用于基因忍片检测过程中的试剂。
[0026] 本发明的优点和有益效果：
[0027] (1)本发明的基因忍片可W同时检测成百个基因，简单快速；
[002引 似本发明的基因忍片对致病基因的检测准确度达100% ;
[0029] (3)采用本发明的基因忍片能够帮助医生更加透彻的了解初级纤毛相关疾病的分 子机理，对合理有效的治疗有极大的指导意义。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见化WYorkColdSpringHarborL油oratory 出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中的实验试剂，如 无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0031] 实施例1基因忍片的制备和探针的保存
[00础 1、探针的合成
[0033] 利用原位合成技术根据探针序列设计合成相应长度的探针，探针序列如SEQID NO. 1-113所示，采用HPLC技术对合成的探针进行纯化。
[0034] 2、洗脱探针
[0035] 将带探针的忍片浸泡于5ml35%氨水中，封闭好放到恒溫旋转器上，旋转2小时 W上，将探针从忍片上洗脱下来，转移到离屯、管2. 0中。
[0036] 3、离屯、抽干
[0037] 将洗脱的探针利用真空浓缩仪进行旋转真空浓缩，至没有液体后停止。
[0038] 4、探针的溶解
[0039] 将浓缩好的探针管中加入200μ1的无RNA及DNA酶的去离子水，縱满震荡1分钟 W上，并合并所有溶解好的探针至一个管中保存。
[0040] 5、生物素标记
[0041] 将生物素利用基因扩增技术标记到已经纯化好的探针上，并利用柱式DNA回收试 剂盒将已经标记的生物素探针进