钉合eIF4E相互作用肽的制作方法

钉合eIF4E相互作用肽的制作方法
【专利说明】巧合elF化相互作用化
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月21日提交的新加坡申请号201302065-6和2014年1月 15日提交的新加坡申请号201400336-2的优先权的权益，运两个新加坡申请的内容出于所 有目的在此W引用方式整体并入。
技术领域
[0003] 本发明属于分子生物学领域并且设及交联肤和其药学用途。
【背景技术】
[0004] 人真核翻译起始因子4E(eIF4巧通过结合见于mRNA的5'端处的帽结构（m^GT巧 来起始帽依赖性翻译。eIF4F常常在大量的癌症中过表达并且通过失调的帽依赖性翻译导 致致癌蛋白质的翻译增加。eIF4E:eIF4G相互作用的抑制剂代表了一种将使癌细胞中的帽 依赖性翻译正常化的可行方法。
[0005]mRNA被假定彼此竞争与eIF4F(真核翻译起始因子4巧蛋白质复合物结合，用于递 送到核糖体和后续翻译。eIF4F与40S核糖体亚单位和eIF3形成复合物。该复合物沿着 mRNA的5'-非翻译区（5' -UTR)穿梭直到它到达AUG起始密码子。多数细胞mRNA的非结 构化的短5' -UTR使得含eIF4E的复合物能够针对翻译起始密码子（AUG)进行有效地扫 描。相比之下，原癌mRNA(例如细胞周期蛋白DLVEG巧的典型的富含G+C的高度结构化的 长5' -UTR妨碍起始复合物识别AUG起始密码子并且导致mRNA被差翻译。当被过表达时 或当eIF4F复合物未被正确调节时，eIF4E通过使具有高度结构化的5'UTR的mRNA的翻译 能够增加而促成恶性。
[0006] 最近的报道已经表明小分子利己韦林（ribavirin)可干扰eIF4E:帽相互作用，因 此可作为eIF4E-祀向疗法呈现一种临床机会。如所预期的，利己韦林治疗选择性地降低关 键的eIF4E依赖性蛋白质如细胞周期蛋白D1的表达并且抑制肿瘤生长。然而，利己韦林实 际上是否结合eIF4E是有争议的。因此，用于研发eIF4E:7-甲基鸟巧帽相互作用的小分子 抑制剂的更定向的方法可能是用于研发eIF4E-特异性小分子疗法的富有成效的方法。迄 今为止，eIF4E-帽相互作用的此类药物样抑制剂还没有被报道。
[0007] 因此，需要提供对eIF4E具有亲和力的新肤，其克服或至少改善一个或多个上述 缺点。

【发明内容】

[0008] 下文描述了与人eIF4E的一部分有关的交联肤。运些交联肤含有至少两个一起 形成内部交联（还被称作钉合体（staple))的经修饰的氨基酸，该内部交联可帮助稳定 eIF4Gl的一部分的α-螺旋二级结构，该α-螺旋二级结构被认为对于eIF4E与eIF4G的 结合是重要的。因此，本文所述的交联肤相对于相应的未交联的肤可具有改进的生物活性。 交联的eIF4Gl肤被认为干扰eIF4Gl与eIF4G的结合，由此抑制具有高度结构化的5'UTR 的mRNA的翻译增加。本文所述的交联的eIF4Gl肤可被治疗性地用于例如治疗或预防受试 者的各种癌症。例如，特征在于不期望地高水平或高活性的eIF4E的癌症或其它病症和/ 或特征在于不期望地高水平活性的含eIF4E的复合物的癌症或其它病症。
[0009] 因此，在第一方面，提供了一种分离肤，其包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序 列组成：
[0010]K'K"RYXaaiXaa2Xaa3Xaa4L?L'°Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaag(SEQIDNO:21)
[0011] 其中：
[0012]Xaai选自由S(丝氨酸）、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0013]Xaa2选自由R(精氨酸）、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0014]Xaa3选自由E(谷氨酸）、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0015]Xaa4选自由F(苯丙氨酸）、Q(谷氨酷胺）、A(丙氨酸）、氨基异下酸和非天然氨基 酸组成的组；
[0016]Xaas选自由G、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0017]Xaae选自由F(苯丙氨酸）、L(亮氨酸）、氨基异下酸、2-氨基下酸和非天然氨基酸 组成的组；
[0018]Xaa,不存在或选自由Q(谷氨酷胺）、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0019] Xaas不存在或选自由F(苯丙氨酸）、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0020] Xaag不存在或选自由氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[00引]其中所述肤包含至少一个将Xaai、Xaa2、Xaa3或X曰曰4与X曰曰5、X曰曰6、X曰曰7、X曰曰8或Xaag连接的肤交联体。
[0022] 在第二方面，提供了一种分离肤，其包含如下氨基酸序列：
[0023]K'K"RYS?R?XaaiXaa2L?L'°Xaa3Xaa4(SEQIDNO:22)
[0024]其中：
[00巧]Xaai选自由E(谷氨酸）、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0026]Xaa2选自由F(苯丙氨酸）、Q(谷氨酷胺）、A(丙氨酸）、氨基异下酸和非天然氨基 酸组成的组；
[0027]Xaa3选自由G、氨基异下酸和非天然氨基酸组成的组；
[0028]Xaa4选自由F(苯丙氨酸）、L(亮氨酸）、氨基异下酸、2-氨基下酸和非天然氨基酸 组成的组；
[0029] 其中所述肤包含至少一个将Xaai或Xaa2与Xaa3或Xaa4连接的肤交联体。
[0030] 在第Ξ方面，提供了一种分离的核酸分子，其编码KKRYSRE化LGF(SEQIDNO: 1)且 经修饰W获得任一种本文所述的肤。
[0031] 在第四方面，提供了一种包含如上文所述的核酸分子的载体。
[0032] 在第五方面，提供了一种包含如本文所述的核酸分子或载体的宿主细胞。
[0033] 在第六方面，提供了一种包含如本文所述的肤或如本文所述的分离的核酸分子或 如本文所述的载体的药物组合物。
[0034] 在第屯方面，提供了本文所公开的肤在制造用于治疗或预防癌症的药剂中的用 途。
[0035] 在第八方面，提供了一种治疗或预防患者的癌症的方法，其包括施用药物有效量 的本文所公开的肤或本文所公开的分离的核酸分子或本文所公开的载体。
【附图说明】
【附图说明】 [0036] 了所公开的实施方案并且用于解释所公开的实施方案的原理。然而，应 当理解，附图仅用于说明的目的，而不是作为本发明范围的定义。
[0037] 图1显示来自W下模拟的代表性瞬态图（snapshot) :A)sTIP-01:eIF4E，其显示 F8由于空间封闭而产生的位移。被空间封闭的F8侧链围绕X-2扭转角旋转并且相对于 eIF4E的表面相当有利地将自身隐匿。F8侧链现在阻碍Y4维持与P38的主链幾基的保守 氨键，使Y4'翻出'且变得更加暴露于溶剂，由此降低其对肤：蛋白质相互作用的能量贡献。 B)TIP-01:eIF4E，其强调运里没有发生F8的此类构象变化，解释了对肤：蛋白质相互作用 的更高能量贡献和因此更高的Kd。C)sTIP-02:eIF4E，其显示与用1，i+4钉合体代替F8和 F12相关的变化。其显示钉合体与所述蛋白质相互作用并且有利地促成了结合。然而，亲 和力改进的缺乏表明钉合的肤并未最佳地替代F8和F12的影响。D)TIP-02:eIF4E，其说明 Y4填充入先前被F8占据的空间中。Y4经历了构象变化并且挤入先前被线性肤中的F8和 sTIP-02中的钉合体占据的空间中。运导致Y4氨键的损失并且削弱了相互作用能量，虽然 L9:W73h-键保持不受运些新的相互作用影响
[003引图2A)描绘了与eIF4E复合的eIF4Gl°5^太的晶体结构（PDBID:4AZA)。检查结 合eIF4E的eIF4G°5s肤的晶体结构W确定钉合体的插入位点。酪氨酸灯4)参与了与eIF4E 的多种范德瓦尔（vanderWaal)接触W及其侧链径基与eIF4E的P38的幾基主链之间的 h-键。亮氨酸化9)在eIF4E的表面上产生浅穴并且通过其主链与色氨酸的吗I噪之间的 h-键与eIF4E的W73相互作用。保守的疏水残基（L10)挤压eIF4E的L131和L135。与 eIF4E复合的两种肤的晶体结构是大约50%α-螺旋的；然而，它们在溶液中含有可忽略的 螺旋含量。蛋白质W表面显示并且肤W卡通图示显示。来自所述肤的所有残基均W棒显示 且被标记。呈现了Υ4:Ρ38和L9:W73之间的氨键。
[003引图2B)是来自与eIF4E复合的eIF4Gl°5s的计算机模拟的代表性瞬态图，其显示Υ4:Ρ38之间缺乏稳定氨键，如即使在没有通过sTIP-01的构象变化对该相互作用施加的破 坏的情况下也在晶体结构中所观察到的。
[0040] 图2C)在上图中分别显示与eIF4E相互作用的sTIP-01肤、sTIP-02肤和sTIP-03 肤的模型中的所有3种连接。下图显示被合并到肤序列中的控连接的结构。钉合体W澄 色显示。Xr=(时-2-(4'-戊締基）丙氨酸并且Xs= (S)-2-(4'-戊締基）丙氨酸。与 eIF4E相互作用的肤通过7位与11位之间、8位与12位之间、8位与11位之间、7位与14 位之间、6位与13位之间、5位与12位之间或8位与15位之间的I，1+4、1，1+3或I，I巧连 接被钉合。
[0041] 图3描绘来自W下模拟的代表性瞬态图：A)sTIP-03:eIF4E复合物，其显示 Υ4:Ρ3她-键的形成W及用Y4和F12对册7的挤压。受约束的C-末端F12主要挤压册7， 册7还与Υ4形成范德瓦尔斯接触。Β)TIP-03eIF4E复合物，其说明类似于sTIP-03与eIF4E 的结合模式的结合模式。构象更不稳定的二AIB类似物肤θ?Ρ-03)与eIF4E的缔合的特 征在于F12、册7与Y4之间的相互作用网络，其类似于sTIP-03中的相互作用网络。
[004引图4显示来自W下模拟的代表性瞬态图：A)sTIP-01?:eIF4E，其描绘了"在内"构 象状态，其中它与Υ4和F12形成堆叠相互作用并且不存在Υ4:P3她-键。B)TIP-01?:eIF4E， 其显示册7与Υ4有利地相互作用并且它们缺乏与F12的相互作用。sTIP-01?和 TIP-01?的模拟掲示Y4、册7和F12之间的相互作用模式影响Υ4:Ρ3她-键的稳定性。C) sTIP-01"2&:eIF4E复合物，其掲示通过引入钉合体，改变2ΑΒ的相互作用，使册7和F8的挤 压显著地改变。D)TIP-01"2&:eIF4E，其显示册7与Y4有利地相互作用，但F8由于2AB的 相互作用而旋转，从而挤压eIF4E。Υ4:Ρ3她-键在sTIP/TIP-01F12&衍生肤的模拟中保持高 度稳定。在TIP-01F12&中，C-末端2AB不与册7形成相互作用。而是，册7与Y4形成疏水 相互作用并且不破坏h-键。1，i+4钉合体的并入通过约束所述螺旋的C-末端区域来诱导 通过所述肤形成的相互作用的构象变化。运使2AB主要与册7相互作用，册7进而与F8堆 叠，导致与eIF4G°5s中的类似的结合模式。
[004引图5A)是sTIP-04:eIF4E的晶体结构的图示，其显示为1. 5截止值的所述肤配体 的2FO-FC图。S5侧链与Q8侧链和肤螺旋的第一转角上的主链酷胺形成相互作用网络，由 此使被结合的复合物稳定。模拟显示两种衍生肤（sTIP-04和TIP-04)中的L9:W73氨键都 非常稳定。
[0044] 图5B)描绘TIP-04:eIF4E复合物的代表性瞬态图，其说明Q8:S5相互作用网络的 维持、Υ4:Ρ3她-键的存在W及H37对L12的更佳挤压。在TIP-04中，H37、L12和Y4的最佳 挤压不破坏保守的氨键。在钉合的衍生物中，由于钉合体固定C-末端，因此H37与L12形 成更有利的范德瓦尔斯接触，运使Y4经历转变而维持有利的挤压。如可由Y4的能量贡献 看出的运一有利的挤压重排使Y4:P3她-键减弱。
[0045] 图6显示TIP和sTIP变体肤的圆二色谱。CD谱掲示钉合体在sTIP-01中比在 TIP-01中或在eIF4G°ss中诱导更大的螺旋度。
[0046] 图7是显示sTIP-01计算机模拟中的F8侧链的化i2(x2)角的图。sTIP-01中的 共价钉合体施加α-螺旋中的刚性，从而增加了在H37、F8与F12之间形成的相互作用网络 上的张力。运导致F8的空间封闭，使一系列的构象变化沿肤：蛋白质界面传播。被空间封 闭的F8侧链围绕X2扭转角旋转并且相当有利地将自身隐匿。
[0047]图8显示来自与eIF4E复合的STIP-01F8A的计算机模拟的代表性瞬态图，其说明 H37处于'外部'位置，Y4占据由于Y8A突变而留出的空间并且F12挤压Y4。H37可见于替代 性的'在内'状态中并且构象变化导致h-键的罕见形成。因此，册7和F12影响Υ4:Ρ3她-键 的稳定性。
[0048] 图9显示来自Α)与eIF4E复合的sTIP-OlTr和Β)与eIF4E复合的TIP-OlTr的 计算机模拟的代表性瞬态图，其显示当去除C-末端F12时，产生F8、Y4和H37的挤压相互 作用的截然不同的重排，运取决于是否存在大环连接。
[0049] 图10显示来自W下模拟的代表性瞬态图：从两种不同构象起始的 sTIP-04:eIF4E。A)源自eIF4E°ss(PDBID:4AZA)复合结构的起始状态和B)从 eIF4E:sTIP-04晶体结构（PDBID:4BEA.PDB)开始的模拟。两种模拟总体上良好的相互一 致，各自在分子内/分子间的相互作用方面显示相同的结构特征，所述相互作用设及Q8-S5 相互作用网络、L12的最佳挤压和Υ4:Ρ38氨键的丧失。
[0050]图11是汇总模拟系统内的肤残基的总自由能分解的表（表3)。
[0051] 图12Α是表示MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞中的归一化发光相对于钉合肤的增 加浓度的点图。将MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞溶解并且将巧光素酶蛋白质添加到溶解 细胞中。随后，将所述细胞与所示浓度的S-TIP03和对照钉合肤解育，显示S-TIP03W剂量 依赖方式降低细胞活力。
[005引图12B显示蛋白质印迹的代表性图像，其表示eIF4e、存活素、Bcl-XL和肌动蛋白 在来自MDA-MB-231细胞的细胞提取物中的蛋白质水平，所述细胞在存在或不存在10%胎 牛血清的情况下生长，所述细胞用预先在100%二甲亚讽（DMSO)中稀释W实现DMSO的1% 最终浓度的所示浓度的钉合肤处理。sTIP-03W剂量依赖方式下调MDA-MB-231细胞中的存 活素和Bcl-XL蛋白质水平。肌动蛋白蛋白质是表明相同量的蛋白质被加载到每个孔中的 载荷对照。
【具体实施方式】
[0053] 在描述本发明肤和其用途之前，应当理解本发明并不限于所述的特定的肤、方法、 用途和实验条件，因为此类肤、方法、用途和条件可W改变。还应当理解，本文所用的术语仅 用于描述具体的实施方案，而不意在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限 制。
[0054] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域技术人 员通常所理解的含义相同。类似或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料均可用 于本发明的实施或测试，因为应当理解，修改和改变涵盖于本公开的精神和范围内。
[00巧]在本发明内，分离的交联肤已被合理地设计成干扰eIF4E-eIF4G界面。生物物理 数据和晶体结构用于支持一组分离肤的分子动态模拟。本发明人发现本文所述的肤W单数 位纳摩尔范围的表观Kd结合，所述范围对应于相对于用来设计本发明肤的线性模板的大约 17到大约25倍的Kd改进。另外，本发明人发现可发生在肤：蛋白质界面处的结构效应，当 通过在所述肤中引入共价钉合体连接来降低构象自由度时，其彼此相互调节。换句话说，本 发明人发现替代性螺旋稳定化策略引起用于结合的多种多样的分子机制并且亲和力的改 进源于补偿性相互作用。
[0056] 肤交联体主要增加所述肤在结合之前在溶液中的螺旋度，但运可被肤：蛋白质界 面处的非最佳相互作用削弱。在本发明的合理设计的肤中，已通过优化界面处的挤压效应、 使被结合的复合物稳定和在溶液中的更高螺旋稳定化克服或至少改善此类限制。例如在本 发明的示例性肤中，交联体仅诱导45 %螺旋度，但运利用在两个氨基酸之间形成（氨）h-键 并且通过所述肤的另一氨基酸的最佳挤压相互作用被补偿。相比之下，另一示例性肤在结 合时可丧失两个氨基酸之间的氨键，但通过在溶液中的更高螺旋度（63%)和通过另一氨 基酸对螺旋结合形式的稳定化发生补偿。运反映在针对运两种肤得到的结合的洽值和赌值 上，其中第一示例性肤具有更有利的洽分量（enthalpiccomponent)且第二示例性肤具有 更有利的赌分量（entropiccomponent)。
[0057] 本发明人发现本发明的分离肤相比于本领域内已知的其它抑制剂是eIF4E的强 效结合剂。本发明人进行的和本文所公开的观察可用于设计用于治疗性应用（例如，在癌 症的治疗中）的新eIF4E抑制剂。
[0058] 祀向eIF4E-帽相互作用的替代方法是选择性地破坏eIF4E与eIF4G的相互作用， 由此使得不能形成eIF4F复合物。祀向eIF4E的替代方法将是使用反义寡核巧酸（AS0)降 低eIF4E蛋白质表达。eIF4EASO已被显示有效地降低一系列广泛的受转染的人和鼠类细 胞中的eIF4ERNA和蛋白质二者，随后降低恶性相关蛋白质-具体来说细胞周期蛋白D1、 VEGF、c-myc、存活素和B化-2的表达。重要地，AS0介导的eIF4E的降低不影响β-肌动蛋 白（一种由"强"mRNA编码的蛋白质）的表达，它也不显著减少总体蛋白质的合成。
[0059] 肤模拟物（Peptidomimetics)代表了一种祀向eIF4E:eIF4G相互作用的替代方 法。呈其自然状态的蛋白质折叠成二级结构区域，如螺旋、折叠和转角。α-螺旋是发现于 蛋白质中的最常见的结构基序之一，且许多生物学重要的蛋白质相互作用通过一种蛋白质 的α-螺旋区域与另一蛋白质的相互作用介导。然而，α-螺旋具有解开并形成无规卷曲 的倾向，所述无规卷曲在多数情况下具有较低生物活性或甚至是非活性的，对其祀具有较 低的亲和力，具有降低的细胞摄取并且极易于发生蛋白水解降解。
[0060] 因此，本发明设及一种分离肤，其可包含沈QIDN0:21(KiK2R3Y4XaaiXaa2Xaa3Xaa4L 9Li°Xaa日XaaeXaa^XaasXaag)所示的氨基酸序列或由沈QIDN0:2UKiK2R3Y4XaaiXaa2Xaa3Xaa4 化1姑曰5乂曰曰6乂曰曰而曰祐曰9)所示的氨基酸序列组成。所述肤可在两个非天然（即非自然的 或合成的）氨基酸之间包含至少一个显著增强所述肤的α螺旋结构的肤交联体（还被称 为钉合体（staple)或系链（tether))。通常，交联体延伸跨过一个或两个螺旋转角的长度 (即约3.4个或约7个氨基酸）。因此，位于1和1+3(间隔3个氨基酸）；^及1和1+4;或 i和i巧处的氨基酸是用于化学改性和交联的理想候选。
[00川 因此，例如，如果肤具有序列：[…]XaaiXaajXaakXaaiXaamXaanXaa"XaapXaaqXaar[…] (其中""表示额外氨基酸的任选存在），则Xaai与Xaa1之间或Xaa1与Xaam之间或Xaa1 与Xaa。之间的交联体与Xaa.j与Xaam之间或Xaa.j与Xaa。之间或Xaa.j与Xaaq之间等的交联 体一样有用。所述肤可包含超过一个交联体W进一步使所述序列稳定或促进更长肤伸展的 稳定。
[0062] 因此，在一个方面，本发明设及上述分离肤，其中所述肤包含Xaai、Xaa2、Xaa3或 Xaa4与Xaa5、Xaae、Xaa^、Xaag或Xaag的至少一个交联体，并且其中Xaa1包括但不限于丝氨 酸（S)、氨基异下酸和非天然氨基酸；Xaa2包括但不限于精氨酸（时、氨基异下酸和非天然 氨基酸；Xaa3包括但不限于谷氨酸巧）、氨基异下酸和非天然氨基酸；Xaa4包括但不限于苯 丙氨酸（巧、谷氨酷胺怕)、丙氨酸（A)、氨基异下酸和非天然氨基酸；Xaas包括但不限于甘 氨酸佑)、氨基异下酸和非天然氨基酸；Xaae包括但不限于苯丙氨酸（巧、亮氨酸巧)、氨基 异下酸、2-氨基下酸和非天然氨基酸，或不存在；Xaa,包括但不限于谷氨酷胺怕)、氨基异 下酸和非天然氨基酸，或不存在；Xaas包括但不限于苯丙氨酸（巧、氨基异下酸和非天然氨 基酸，或不存在；并且Xaag包括但不限于氨基异下酸和非天然氨基酸，或不存在。
[0063] 如本文所用的术语"交联体"或其语法变型是指两个肤结构域（例如螺旋肤的两 个环）的分子内连接体（还被称作钉合体）。当所述肤具有螺旋二级结构时，交联体是大 环，它是外源（非其一部分）的核屯、或固有（非交联）的螺旋肤结构。大环可包含全控连 接环并且包含连接到所述肤的至少两个氨基