用于预防、诊断或者治疗癌症或血管发生相关疾病的抗vegf抗体和含有所述抗体的药物 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及：与血管内皮生长因子（VEG巧结合的新抗体，W及包含所述新抗体的 药物组合物；所述新抗体具有对VEGF的强结合亲和力并因此可用于治疗癌症或血管发生 相关疾病。
【背景技术】
[0002] 众所周知，血管发生参与多种疾病的发病机制，所述疾病包括实体瘤、与眼的新血 管生成有关的增殖性视网膜病变或年龄相关的黄斑变性（AMD)等。
[0003] 已经在对血管发生的研究中鉴定了多种诱导因子，例如aFGF、bFGF、 TGF-a、TGF-e、HGF、TNF-e和血管生成素。血管发生抑制剂可包括血小板反应蛋 白（t虹ombospondin)(IGkDa的促乳素N端片段（Clapp等，E；ndoc;rinology，l33 : 1292-1299(1993))、制管张素（angiostatin)和内皮抑制素（endostatin)等。
[0004] 诱导还是抑制血管发生取决于血管发生诱导物和抑制物之间的平衡（fo化man,J， 等，J.Biol.Chem.，267,10931-10934 (1992))。
[0005] 在血管发生诱导物中，血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowth factor,VEG巧参与血管和淋己管的发育和稳态，并且还对神经细胞表现出显著作用。在 低氧情况下或者响应于通过细胞生长因子（例如TGF、白细胞介素和PDGF)的刺激，主要 在血管内皮细胞、造血细胞和基质细胞中产生VEGF。VEGF与VEGF受体结合，并且VEGF的 每一种同种型结合特异性受体，运诱导受体的同源或异源缀合物形成，从而活化每个信号 转导通路化arsanA.，IntJ.Mol.Med.，5 巧）：447-56(2000))。VEGF受体的信号转导特 异性受到共同受体（例如神经拉蛋白（neuri地ilin)、硫酸肝素化巧arinsul化te)、整联 蛋白（integrin)、巧黏着蛋白（ca化erin)等）更精细的调节狂achary1C，等，Mol.Biol. Cell. ,22(15) :2766-76(2011))。已知VEGF是肿瘤和眼中血管发生相关疾病的重要介体。 另外，在被调查的大多数对象中，肿瘤过表达VEGFmRNA度erkman等，J.Clin.Invest.， 91 :153-159(1993))。由于癌症为了其生长需要新的毛细血管作为用于营养物供应和废 物排出的通道W用于其成长，癌症细胞及其基质细胞持续分泌VEGF，其扩散到整个组织并 刺激血管内皮细胞的迁移（Ferrara.N等，化t.Rev.Cancer, 2 :795-803, (2002))。与正 常形成的毛细血管相比，由癌症细胞诱导的新脉管系统的特征在于不完整，因为它们独立 于周围的细胞。尽管VEGF与受体VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3结合，但VEGF通过VEGFR2 来递送信号，从而导致内皮细胞的增殖、迁移和渗透性狂engH.等，J.Biol.化em.，276: 26969-26976 (2001))。因此，通过使用祀向VEGF的药物控制血管发生，可治疗癌细胞的增 殖W及与血管发生相关的疾病。其中，与VEGF结合的抗体可用于药物，其经历人源化过程 W提高对VEGF的结合亲和力并降低抗体的免疫原性。人源化的抗体描述于文献度ending， Methods:Comp.Meth.化巧.，8 :83-93(1995))中。抗VEGF中和抗体在裸鼠中阻抑多种人 肿瘤细胞系的生长化im等，化 1:ure.，362 :841-844(1993);Warren等，J.Clin.Invest.， 95:1789-1797(1995) ;Bo;rgst;roem等，CancerRes. ,56:4032-4039(1996);和Melnyk等，CancerRes.，56 :921-924(1996)),并在视网膜的缺血性血管病症模型中阻抑眼内血管发 生（Adamis等，Arch.Ophtalmol.，114 :66-71 (1996))。抗VEGF抗体可WW有效降低VEGF 之活性的浓度局部地施用到眼中。运样的缺血性视网膜病症可包括糖尿病性视网膜病变或 年龄相关的黄斑变性。
[0006] 目前所开发的抗VEGF中和抗体包括贝伐单抗化evacizumab，阿瓦斯汀 (Avastin?)，Genentech/Roche)，其被FDA于2004年2月批准用于结肠直肠癌。贝伐单 抗的适应症已经拓展至总共六种类型的进行性肿瘤的治疗，所述肿瘤包括转移性结肠直肠 癌和进行性卵巢癌。另外，设计成与VEGF结合的阿柏西普（AfliberceptHBayer化alth Care)的上市许可申请于2011年被抑A批准用于黄斑变性的治疗。然而，抑A于2011年撤 回了阿瓦斯汀（）的乳腺癌相关适应症，因为与安慰剂相比，其未能在乳腺癌患 者中表现出总生存率的显著提高。随后的报告指出，阿瓦斯汀提高了乳腺癌患者中屯、力衰 竭的风险，表明需要改进之前开发的抗VEGF中和抗体，并需要确定其在临床前阶段的精确 功效。因为阿瓦斯汀不结合小鼠VEGF，所W难W准确确定其在使用小鼠的临床前模型中的 功效。因此，本发明的一个目的是开发与小鼠VEGF和人VEGF二者结合的抗体，从而获得临 床前模型中结果的可靠性；W及提高抗体对VEGF的结合亲和力，从而改进抗肿瘤效果。
[0007] 通过生物淘选和亲和力提高，本发明人已经开发了包含之前未知的新互补决定区 (CDR)的抗体，并且通过其与VEGF的特异性结合所述抗体能够治疗肿瘤和多种眼内新生血 管性病症。
[000引发明概述
[0009] 因此，本发明的一个目的是提供特异性结合VEGF的抗体。
[0010] 本发明的另一个目的是提供包含上述抗体的药物组合物。
[0011] 为实现本发明如上所述的目的，提供了与血管内皮生长因子（VEG巧结合的抗体， 所述抗体包含：
[0012] 1)轻链可变区，其包含互补决定区（CDR)UCDR2和CDR3,其中CDR2由沈QIDNO 1的氨基酸序列示出；并且CDR3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出；W及
[0013] 2)重链可变区，其包含CDRUCDR2和CDR3,其中所述CDR3由沈QIDNO3的氨基 酸序列示出。
[0014] 为实现本发明如上所述的另一个目的，提供了包含上述抗体的药物组合物，其用 于预防、诊断或者治疗由VEGF过表达引起的血管发生相关病症或癌症。
[0015] 本发明的抗体表现出对人VEGF和小鼠VEGF的明显结合特性，阻抑人厮静脉内皮 细胞（HUVEC)的增殖和渗透性并抑制肿瘤生长，因此可用作用于预防、诊断或者治疗癌症 或血管发生相关病症的抗体。
【附图说明】
[0016]当结合附图时，根据本发明的W下描述，本发明的W上W及其他目的和特征将变 得明显。
[0017] 图1示出克隆HF2-11与VEGF的结合与解离的传感图。
[0018] 图2是示出本发明抗体抑制VEGF与VEGFR2之结合，而不抑制VEGF与VEGFR1之 结合的图。
[0019] 图3是示出本发明抗体与人和小鼠VEGF-A特异性结合的图。
[0020] 图4示出HF2-11克隆的SDS-PAGE结果。
[0021] 图5示出抗体HF2-4的重链（a)和轻链化）的质量分析结果。
[002引图6示出HF2-8克隆的尺寸排阻色谱法（SEC)的结果。
[002引 图7和8示出通过ELISA测量的本发明抗体和阿瓦斯汀与人和小鼠VEGF抗体的 结合特性的结果。
[0024] 图9示出本发明抗体和阿瓦斯汀对人厮静脉内皮细胞（HUVEC)增殖之阻抑活性的 测试结果。
[002引图10示出本发明抗体（a)和阿瓦斯汀化）对HUVEC渗透性之阻抑活性的测试结 果。
[0026] 图11示出本发明抗体对HUVEC迁移之阻抑活性的测试结果。
[0027] 图12示出本发明抗体在植入HT29的动物模型中对肿瘤生长的抑制活性。
[0028] 图13示出本发明抗体对脉络膜血管发生的阻抑活性。
[002引发明详述
[0030] 在本发明中，提供了与VEGF结合的抗体（下文称作"抗VEGF抗体"），所述抗体包 含1)轻链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3,其中所述CDR2由SEQIDNO1的氨基酸序 列示出；并且CDR3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出；W及2)重链可变区，其包含CDR1、 CDR2和CDR3,其中所述CDR3由SEQIDNO3的氨基酸序列示出。
[0031] 在下表1中示出根据本发明之抗体的轻链可变区的CDRUCDR2和CDR3(下文分别 称作LCDRULCDR2和LCDR：3)的氨基酸序列；W及根据本发明之抗体的重链可变区的CDR1、 CDR2和CDR3 (下文分别称作HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列的列表。
[0032] [表1]轻链和重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列
[0033]
[0035] 根据本发明的与VEGF结合的抗体可包含：1)轻链可变区，其包含选自SEQIDNO 4至14的氨基酸序列示出的CDRl、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQID NO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区，其包含由选自SEQIDNO15至34的 氨基酸序列示出的CDRl、由选自SEQIDNO35至50的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQID NO3的氨基酸序列示出的CDR3。
[0036] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO4的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO15的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO35的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0037] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO16的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO36的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0038] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO17的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO37的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0039] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO18的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0040] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO19的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO39的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0041] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO20的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO40的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0042] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO21的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0043] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO22的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0044] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQ IDNO7的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO23的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO41的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0045] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SE