用于预防、诊断或者治疗癌症或血管发生相关疾病的抗vegf抗体和含有所述抗体的药物...的制作方法

文档序号:9509676
用于预防、诊断或者治疗癌症或血管发生相关疾病的抗vegf抗体和含有所述抗体的药物 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及:与血管内皮生长因子(VEG巧结合的新抗体,W及包含所述新抗体的 药物组合物;所述新抗体具有对VEGF的强结合亲和力并因此可用于治疗癌症或血管发生 相关疾病。
【背景技术】
[0002] 众所周知,血管发生参与多种疾病的发病机制,所述疾病包括实体瘤、与眼的新血 管生成有关的增殖性视网膜病变或年龄相关的黄斑变性(AMD)等。
[0003] 已经在对血管发生的研究中鉴定了多种诱导因子,例如aFGF、bFGF、 TGF-a、TGF-e、HGF、TNF-e和血管生成素。血管发生抑制剂可包括血小板反应蛋 白(t虹ombospondin)(IGkDa的促乳素N端片段(Clapp等,E;ndoc;rinology,l33 : 1292-1299(1993))、制管张素(angiostatin)和内皮抑制素(endostatin)等。
[0004] 诱导还是抑制血管发生取决于血管发生诱导物和抑制物之间的平衡(fo化man,J, 等,J.Biol.Chem.,267,10931-10934 (1992))。
[0005] 在血管发生诱导物中,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowth factor,VEG巧参与血管和淋己管的发育和稳态,并且还对神经细胞表现出显著作用。在 低氧情况下或者响应于通过细胞生长因子(例如TGF、白细胞介素和PDGF)的刺激,主要 在血管内皮细胞、造血细胞和基质细胞中产生VEGF。VEGF与VEGF受体结合,并且VEGF的 每一种同种型结合特异性受体,运诱导受体的同源或异源缀合物形成,从而活化每个信号 转导通路化arsanA.,IntJ.Mol.Med.,5 巧):447-56(2000))。VEGF受体的信号转导特 异性受到共同受体(例如神经拉蛋白(neuri地ilin)、硫酸肝素化巧arinsul化te)、整联 蛋白(integrin)、巧黏着蛋白(ca化erin)等)更精细的调节狂achary1C,等,Mol.Biol. Cell. ,22(15) :2766-76(2011))。已知VEGF是肿瘤和眼中血管发生相关疾病的重要介体。 另外,在被调查的大多数对象中,肿瘤过表达VEGFmRNA度erkman等,J.Clin.Invest., 91 :153-159(1993))。由于癌症为了其生长需要新的毛细血管作为用于营养物供应和废 物排出的通道W用于其成长,癌症细胞及其基质细胞持续分泌VEGF,其扩散到整个组织并 刺激血管内皮细胞的迁移(Ferrara.N等,化t.Rev.Cancer, 2 :795-803, (2002))。与正 常形成的毛细血管相比,由癌症细胞诱导的新脉管系统的特征在于不完整,因为它们独立 于周围的细胞。尽管VEGF与受体VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3结合,但VEGF通过VEGFR2 来递送信号,从而导致内皮细胞的增殖、迁移和渗透性狂engH.等,J.Biol.化em.,276: 26969-26976 (2001))。因此,通过使用祀向VEGF的药物控制血管发生,可治疗癌细胞的增 殖W及与血管发生相关的疾病。其中,与VEGF结合的抗体可用于药物,其经历人源化过程 W提高对VEGF的结合亲和力并降低抗体的免疫原性。人源化的抗体描述于文献度ending, Methods:Comp.Meth.化巧.,8 :83-93(1995))中。抗VEGF中和抗体在裸鼠中阻抑多种人 肿瘤细胞系的生长化im等,化 1:ure.,362 :841-844(1993);Warren等,J.Clin.Invest., 95:1789-1797(1995) ;Bo;rgst;roem等,CancerRes. ,56:4032-4039(1996);和Melnyk等,CancerRes.,56 :921-924(1996)),并在视网膜的缺血性血管病症模型中阻抑眼内血管发 生(Adamis等,Arch.Ophtalmol.,114 :66-71 (1996))。抗VEGF抗体可WW有效降低VEGF 之活性的浓度局部地施用到眼中。运样的缺血性视网膜病症可包括糖尿病性视网膜病变或 年龄相关的黄斑变性。
[0006] 目前所开发的抗VEGF中和抗体包括贝伐单抗化evacizumab,阿瓦斯汀 (Avastin?),Genentech/Roche),其被FDA于2004年2月批准用于结肠直肠癌。贝伐单 抗的适应症已经拓展至总共六种类型的进行性肿瘤的治疗,所述肿瘤包括转移性结肠直肠 癌和进行性卵巢癌。另外,设计成与VEGF结合的阿柏西普(AfliberceptHBayer化alth Care)的上市许可申请于2011年被抑A批准用于黄斑变性的治疗。然而,抑A于2011年撤 回了阿瓦斯汀()的乳腺癌相关适应症,因为与安慰剂相比,其未能在乳腺癌患 者中表现出总生存率的显著提高。随后的报告指出,阿瓦斯汀提高了乳腺癌患者中屯、力衰 竭的风险,表明需要改进之前开发的抗VEGF中和抗体,并需要确定其在临床前阶段的精确 功效。因为阿瓦斯汀不结合小鼠VEGF,所W难W准确确定其在使用小鼠的临床前模型中的 功效。因此,本发明的一个目的是开发与小鼠VEGF和人VEGF二者结合的抗体,从而获得临 床前模型中结果的可靠性;W及提高抗体对VEGF的结合亲和力,从而改进抗肿瘤效果。
[0007] 通过生物淘选和亲和力提高,本发明人已经开发了包含之前未知的新互补决定区 (CDR)的抗体,并且通过其与VEGF的特异性结合所述抗体能够治疗肿瘤和多种眼内新生血 管性病症。
[000引发明概述
[0009] 因此,本发明的一个目的是提供特异性结合VEGF的抗体。
[0010] 本发明的另一个目的是提供包含上述抗体的药物组合物。
[0011] 为实现本发明如上所述的目的,提供了与血管内皮生长因子(VEG巧结合的抗体, 所述抗体包含:
[0012] 1)轻链可变区,其包含互补决定区(CDR)UCDR2和CDR3,其中CDR2由沈QIDNO 1的氨基酸序列示出;并且CDR3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出;W及
[0013] 2)重链可变区,其包含CDRUCDR2和CDR3,其中所述CDR3由沈QIDNO3的氨基 酸序列示出。
[0014] 为实现本发明如上所述的另一个目的,提供了包含上述抗体的药物组合物,其用 于预防、诊断或者治疗由VEGF过表达引起的血管发生相关病症或癌症。
[0015] 本发明的抗体表现出对人VEGF和小鼠VEGF的明显结合特性,阻抑人厮静脉内皮 细胞(HUVEC)的增殖和渗透性并抑制肿瘤生长,因此可用作用于预防、诊断或者治疗癌症 或血管发生相关病症的抗体。
【附图说明】
[0016]当结合附图时,根据本发明的W下描述,本发明的W上W及其他目的和特征将变 得明显。
[0017] 图1示出克隆HF2-11与VEGF的结合与解离的传感图。
[0018] 图2是示出本发明抗体抑制VEGF与VEGFR2之结合,而不抑制VEGF与VEGFR1之 结合的图。
[0019] 图3是示出本发明抗体与人和小鼠VEGF-A特异性结合的图。
[0020] 图4示出HF2-11克隆的SDS-PAGE结果。
[0021] 图5示出抗体HF2-4的重链(a)和轻链化)的质量分析结果。
[002引图6示出HF2-8克隆的尺寸排阻色谱法(SEC)的结果。
[002引 图7和8示出通过ELISA测量的本发明抗体和阿瓦斯汀与人和小鼠VEGF抗体的 结合特性的结果。
[0024] 图9示出本发明抗体和阿瓦斯汀对人厮静脉内皮细胞(HUVEC)增殖之阻抑活性的 测试结果。
[002引图10示出本发明抗体(a)和阿瓦斯汀化)对HUVEC渗透性之阻抑活性的测试结 果。
[0026] 图11示出本发明抗体对HUVEC迁移之阻抑活性的测试结果。
[0027] 图12示出本发明抗体在植入HT29的动物模型中对肿瘤生长的抑制活性。
[0028] 图13示出本发明抗体对脉络膜血管发生的阻抑活性。
[002引发明详述
[0030] 在本发明中,提供了与VEGF结合的抗体(下文称作"抗VEGF抗体"),所述抗体包 含1)轻链可变区,其包含CDR1、CDR2和CDR3,其中所述CDR2由SEQIDNO1的氨基酸序 列示出;并且CDR3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出;W及2)重链可变区,其包含CDR1、 CDR2和CDR3,其中所述CDR3由SEQIDNO3的氨基酸序列示出。
[0031] 在下表1中示出根据本发明之抗体的轻链可变区的CDRUCDR2和CDR3(下文分别 称作LCDRULCDR2和LCDR:3)的氨基酸序列;W及根据本发明之抗体的重链可变区的CDR1、 CDR2和CDR3 (下文分别称作HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列的列表。
[0032] [表1]轻链和重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列
[0033]

[0035] 根据本发明的与VEGF结合的抗体可包含:1)轻链可变区,其包含选自SEQIDNO 4至14的氨基酸序列示出的CDRl、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQID NO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区,其包含由选自SEQIDNO15至34的 氨基酸序列示出的CDRl、由选自SEQIDNO35至50的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQID NO3的氨基酸序列示出的CDR3。
[0036] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO4的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO15的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO35的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0037] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO16的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO36的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0038] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO17的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO37的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0039] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO18的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0040] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3;W及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO19的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO39的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0041] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO20的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO40的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0042] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO21的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0043] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO22的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0044] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SEQ IDNO7的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQ IDNO2的氨基酸序列示出的CDR3 及2)重链可变区,其包含由SEQIDNO23的氨基酸 序列示出的CDR1、由SEQIDNO41的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸 序列示出的CDR3。
[0045] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含:1)轻链可变区,其包含由SE
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