>[008引根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQ ID NO 61的氨基酸 序列示出的轻链可变区；W及2)由SEQ ID NO 102的氨基酸序列示出的重链可变区。
[0089] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQ ID NO 64的氨基酸 序列示出的轻链可变区；W及2)由SEQ ID NO 103的氨基酸序列示出的重链可变区。
[0090] 根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQ ID NO 65的氨基酸 序列示出的轻链可变区；W及2)由SEQ ID NO 104的氨基酸序列示出的重链可变区。
[0091] 本发明的抗体可包含轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和重量恒定区 可W是公众已知的人抗体的轻链恒定区和重链恒定区扣Rutishauser等，PNAS，61(4): 1414-1421(1968);和Tak址ashiN.，等，Cell, 29 :671-679 (19的））。
[0092] 根据本发明的抗体可W是人抗体或人源化抗体。
[0093] 根据本发明的抗体可W包括免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、I曲、 I姐或IgM，W及可W为与VEGF结合的抗体，或者其组合或变体。
[0094] 根据本发明的抗体的形式可W为F油、F油'、F(油'）2^￥、(^6、3[。￥或骨架缀合 物，其中所述抗体的CDR是用于与VEGF结合的主要部分。
[009引另外，在本发明中，提供了选自SEQIDNO66至77的碱基序列，其编码由选自SEQ IDNO54至65的氨基酸序列示出的轻链可变区。
[0096] 在本发明中，提供了选自SEQIDNO105至131的碱基序列，其编码由选自SEQID NO78至104的氨基酸序列示出的重链可变区。
[0097] W下在表2中示出了本发明抗体的轻链和重链之可变区的氨基酸序列和对应碱 基序列的列表。
[0098][表 2]
[0099]
[0100]
[0101] 另外，在本发明中，提供了编码与VEGF结合之抗体的轻链可变区的DM,所述轻链 可变区包含由SEQ ID NO 1的氨基酸序列示出的CDR2及由SEQ ID NO 2的氨基酸序列 示出的CDR3。
[010引 编码由沈Q ID NO 1的氨基酸序列示出之CDR 2的DNA可W由沈Q ID NO 51的 碱基序列示出；并且编码由SEQ ID NO 2的氨基酸序列示出之CDR3的DM可W由SEQ ID NO 52的碱基序列示出。
[0103] 因此，编码本发明抗体之轻链可变区的DNA序列可包含编码LCDR2的SEQ ID NO 51的碱基序列；W及编码LCDR3的SEQ ID NO 52的碱基序列.
[0104] 在本发明中，提供了编码与VEGF结合之抗体的重链可变区的DM,所述重链可变 区包含由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
[010引 编码由沈QIDNO3的氨基酸序列示出之CDR3的DNA可W由沈QIDNO53的 碱基序列示出。
[0106] 编码抗VEGF抗体的重链可变区的DNA可包含编码HCDR3之沈QIDNO53的碱基 序列。
[0107] 在本发明中，提供了包含编码抗体轻链可变区之DNA的表达载体，所述载体表达 与VEGF结合之抗体的轻链可变区。
[0108] 优选地，提供了包含W下的表达载体：编码由SEQIDNO1的氨基酸序列示出之 CDR2的SEQIDNO51的碱基序列讯编码由SEQIDNO2的氨基酸序列示出之CDR3的 沈QIDNO52的碱基序列。
[0109] 另外，在本发明中，提供了包含编码抗VEGF抗体之重链可变区的DNA的表达载体， 所述载体表达与VEGF结合之抗体的重链可变区。
[0110] 优选地，提供了包含编码由SEQIDNO3的氨基酸序列示出之CDR3的碱基序列的 表达载体，所述载体表达与VEGF结合之抗体的重链可变区。
[0111] 可W将本发明的表达载体转染到动物细胞系中，例如C册细胞、肥K细胞或NS0细 胞，但不限于此。
[0112] 另外，在本发明中，提供了包含编码抗体之轻链可变区的DNA的表达载体，所述载 体表达与VEGF结合之抗体的轻链可变区。
[0113] 血管发生指从先前存在的毛细血管形成新的毛细血管。本文所用的"血管发生相 关疾病"涵盖由VEGF过表达引起的与血管发生相关的所有疾病或病症。"血管发生相关疾 病"可W包括多种癌症和眼部病症等，但不限于此。在本发明中，由VEGF过表达引起的血管 发生相关疾病或癌症可W选自：选自结肠直肠癌、膜腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和脑 癌的癌症；W及选自黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和缺血性视网膜病变的眼部病症；等 等。
[0114] 临床实践中，抗VEGF抗体可W与药物组合使用，所述药物例如，基于氣喀晚的药 物、紫杉醇、基于销的药物、干扰素α-2a、卡销等（抑AUS化125085阿瓦斯汀标签）。
[0115] 除了W上抗体之外，本发明的药物组合物还可W与选自W下的药物组合使用：基 于氣喀晚的药物、紫杉醇、基于销的药物、干扰素α-2a、卡销、多柔比星（doxorubicin)、顺 销、吉西他滨、5-氣尿喀晚、甲酯四氨叶酸、伊立替康、奥沙利销（為^^2|蓄3]-€、卡培 他滨和多西他赛，但不限于此。
[0116] 显示出抗癌活性的任何化学治疗剂均可W与本发明的药物组合物组合使用。化学 治疗剂可W选自烷基化剂、抗代谢物、叶酸同系物、喀晚同系物、嚷岭同系物和相关抑制剂， 长春花生物碱、表鬼白毒素、抗生素、k天冬酷胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、销配合物、 蔥二酬取代的尿素、甲基阱衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激 素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素和促性腺激素释放激素同系物。
[0117] 在本发明中，提供了用于癌症或由VEGF过表达引起的血管发生相关疾病的诊断 试剂盒，所述试剂盒包含与VEGF结合的抗体。血管发生相关疾病的实例如上所述。
[0118] 根据本发明的抗体不影响VEGF与VEGF受体Flt-1 (VEGFR-1)之间的结合，但选择 性地抑制VEGF与VEGF受体KDR(VEGFR-2)之间的结合（图2)。另外，所述抗体根本不结合 人VEGF-B、人VEGF-C、人VEGF-D或人胎盘生长因子（PIGF)，但对人VEGF-A和小鼠VEGF-A 显示出高的结合特异性（图3)。
[0119] 通过酶联免疫吸附测定巧LISA)来评估本发明的抗体对人血管内皮生长因子的 结合亲和力。结果，所述抗体显示出对人VEGF的浓度依赖性结合（图7)。与之前的现有 抗VEGF抗体阿瓦斯汀（其不显示出对小鼠VEGF的结合）相比，所述抗体还显示出对小鼠 VEGF的优异结合，表明本发明的抗体适合用于使用小鼠的临床前研究（图8)。
[0120] 此外，本发明的抗体阻抑人厮静脉内皮细胞（HUVEC)的增殖（VEGF刺激HUVEC渗 透性和HUVEC迁移），其程度等于或大于阿瓦斯汀（图9至11)，并且在植入人结肠癌细胞 系的小鼠中阻抑肿瘤生长，其程度远远超过阿瓦斯汀（图12)。与对照组相比，本发明的抗 体还显著阻抑脉络膜血管发生模型中的血管发生（图13)。因此，本发明的人（或人源化 的）抗体可W用于治疗癌症或血管发生相关疾病，并且因此本发明提供了用于预防和治疗 癌症或血管发生相关疾病之包含上述抗体的组合物。
[0121]
[0122] 在本发明中/'VEGF"不仅指165-氨基酸人血管内皮生长因子W及相关的121-氨 基酸、189-氨基酸和206-氨基酸血管内皮生长因子，也指天然人血管内皮生长的等位基 因形式或经修饰的形式（参见[Leung等，Science.，246 :1306(1989);和Houck等，Mol. Endocrin. ,5 ： 1806 (1991)])〇
[0123] 在本发明中，"抗VEGF抗体"指通过阻碍VEGF与VEGF受体结合来使VEGF活化细 胞失活或者在VEGF已经与VEGF受体结合之后抑制血管内皮细胞之活化而发挥作用的抗 体。
[0124] 在本发明中抗体"指显示出与某些抗原特异性结合的糖蛋白。"人源化"形式的 非人（例如晒齿类动物）抗体是包含来自非人免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗体。大多数 情况下，通过用具有期望特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物的高 变区残基替换人免疫球蛋白的高变区残基来构建人源化抗体。在一些情况下，用对应的非 人残基替代人免疫球蛋白的框架区（FR)残基。
[01巧]在本发明中，"单链Fv"或"scFv"抗体片段包含存在于单个多肤链中的抗体的Vh和\结构域。一般而言，Fv多肤还包含帮助scFv形成与抗原结合之适当结构的Vh和Vl结 构域之间的多肤接头。
[0126] 在本发明中/卞油抗体片段"是通过用木瓜蛋白酶消化抗体获得的片段，其中抗体 的Vh和吉构域，W及CH1和化结构域通过S-S键连接，并且其具有抗原结合功能。
[0127] 在本发明中/卞(油'）2抗体片段"指不包含Fc(CH2和邸3)片段的抗体部分。 F(油'）2抗体片段可W通过在其较链区下对抗体进行切割构建。
[0128]在本发明中/卞油'"是较链区切掉的F(油'）2抗体片段的形式；并具有两个-SH 基团。
[0129] 在本发明中，'卞V"指抗体的可变区，而"dAb"指单个结构域抗体片段。
[0130] 在本发明中，"VEGF受体"指VEGF的细胞受体，一般而言，指能够与hVEGF结合的 细胞表面受体或其变体。VEGF受体的一个实例是酪氨酸激酶的跨膜受体，特别是fms型酪 氨酸激酶（fit)(参见[De化ies等，Science.，255 :989 (1992);Shibuya等，Oncogene.，5 ; 519 (1990) ])。Fit受体包含胞外结构域、跨膜结构域和具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构 域。虽然胞外结构域与VEGF结合有关，而细胞内结构域与信号转导相关。VEGF受体的另一 个实例是flk-1受体（下文被称为"邸R")(参见[Matthews等，Proc.化t.Acad.Sci.，88 : 9026 (1991)Jerman等，Oncogene.，6 :1677 (1991))。
[0131] 下文中，将用W下实施例更加详细地描述本发明。提供W下实施例来举例说明本 发明，但本发明的范围不限于此。
[0132] 实施例1.VEGF免疫和cDNA文库构建
[0133] 为了选择特异性结合VEGF的抗体，从免疫的动物构建抗体文库。通过从用抗原免 疫的动物的免疫细胞获得mRNA来构建文库，通过使用抗体基因之引物组合的PCR扩增抗体 基因，并将运些基因克隆到用于隧菌体展示的载体中。
[0134] 具体地，将人VEGF和小鼠VEGF(R&DSystems,美国）与弗氏完全佐剂（complete 化eund'Sadjuvant)和弗氏不完全佐剂（Sigma,美国）混合，并将其混合物W3周的间 隔皮下注射到3只白色来航鸡中5次。获得经免疫动物的血清，使用PBSB(含3%牛血清 蛋白的憐酸盐缓冲液）: 100、1 : 500、1 : 2500和1 : 12500稀释并储存，然后通过 酶免疫测定来评估其与人VEGF和小鼠VEGF的结合。对于化ISA板，分别用0. 2μg/mL人 VEGF(VEGF-165,R&DSystems,美国）和小鼠VEGF(VEGF-164,R&DSystems,美国）各自在 4°C下包被过夜，然后添加上述稀释的血清，并进行反应2小时。用PBST(含0. 1 %tween-20 的PB巧洗涂3次后，添加抗鸡免疫球蛋白辣根过氧化物酶化orseradishperoxidase, HRP) (1 : 3000)并进行反应1小时。用PBST洗涂3次后，添加超TMBOliermo,美国）并允 许显色7分钟，使用微板阅读仪（microplatereader)测量在650皿下的吸光度。免疫前 的血清不结合VEGF，并且选择产生强烈结合人VEGF和小鼠VEGF二者之血清的动物。
[0135] 在最后一次注射后5天，从所选的鸡收集骨髓、脾和腔上囊组织。将组织与 10血TRI试剂（Mole州larResearchCenter,美国）混合，匀浆，然后添加20血TRI试剂， 离屯、W获得上清液。添加3mL的1-漠-3-氯丙烷（l-b;rom〇-3-chlo;rop;ropane，BCP)之后， 离屯、后获得上清液。通过用15血异丙醇处理来沉淀总RNA。使用SuperScript转录系统 (Invitrogen，美国）和随机六聚体（randomhexamer)作为引物，进行逆转录反应（65°C，5 分钟；4°C，5分钟；50°C，50分钟；85°C，5分钟拟及4°C)。将5μL的反应溶液（含有从逆 转录反应得到的cDNA)上样到1%琼脂糖凝胶并进行电泳，并且验证具有多种长度的cDNA -W* J巿'〇
[0136] 实施例2.抗体文库的构建 阳137] (2-1)免巧杭体基闲的扩蜡
[0138] 为扩增鸡抗体的重链可变区和轻链可变区（Vh和V蔚构域），如下进行PCR反应。
[0139] 使用实施例1中制备的cDNA作为模板，设计用于Vh和V 及连接VΗ和VL之单 链Fv(scFv)的引物组合，进行PCR反应。将0. 5μΙVh和V诚各cDNA文库，30pmole正向 引物，30pmole反向引物，10XPCR缓冲液，200μMdNTP和0.5μLTaqDNA聚合酶混合至 50μL的终体积。将混合物在94°C反应5分钟，然后重复W下反应30个循环：94°C，15秒； 56°(：，30秒和72°(：，90秒。
[0140][表3]PCR反应中使用的引物
[0141]
[0142] 将PCR扩增的抗体DM在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，W根据大小分离每种扩增的 DNA，并使用凝胶提取试剂盒（