RGD四肽修饰的β-咔啉，其制备，活性和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser, I- (4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Phe和1_ (4_羟基_3_甲 氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Val，涉及它们的制备方法，涉及它们的纳米 结构和应用。本发明属于生物医药领域。 技术背景
[0002] 恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤 并发的炎症、血栓和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90%以上的恶性肿瘤患者都是 死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞 噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血 管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织；4)炎症使进入正常组织的肿瘤细胞成 长为转移的新生肿瘤。
[0003] 由于现有抗肿瘤药物不具备抗炎症、抗血栓和抗转移作用，所以疗效不理想。发明 同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤转移作用的药物是临床的迫切需求。
[0004] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素ανβ3的阻断剂。申请人曾经报道在浓 度为ΙμΜ时它们可以抑制肿瘤细胞粘附和浸润。申请人曾经把它们与雌激素偶联，制备没 有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把它们与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高 效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及 1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的 β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构类型的代表。 尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤、抗 炎症、抗血栓和抗肿瘤细胞粘附迁移和浸润作用的化合物。
[0005] 发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将RGDS，RGDV或 RGDF与1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸偶联，形成的1-(4-羟基-3-甲 氧羰基苯基）_β_咔啉_3_甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Phe和1_(4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 酰-Arg-Gly-Asp-Val会同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤细胞粘附迁移和浸润作 用的化合物。基于这个认识，发明人提出了本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个内容是提供下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser(Phe，Val)。
[0007]
[0008] 本发明的第二个内容是提供1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔啉-3-甲 酰-Arg-Gly-Asp-Ser(Phe，Val)的制备方法，该方法由以下步骤构成：
[0009] (1)在浓硫酸存在下，5-甲酰水杨酸在甲醇中微波90°C反应2h，生成5-甲酰水杨 酸甲酯；
[0010] (2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；
[0011] (3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水杨酸和L-色氨酸苄酯缩合为 1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
[0012] (4)在2, 3-二氯-5,6-二腈基-1，4-苯醌（DDQ)的存在下，1-(4-羟基-3-甲氧 羰基苯基）-1，2,3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃（THF)中氧化为1-(4-羟 基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
[0013] (5)在Pd/C和Η2存在下，在甲醇中1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧 酸苄酯反应生成1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸；
[0014] (6)采用逐步缩合法，在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反应，得到全保护多肽 序列Boc-Arg(NO〗）-Gly-Asp (OBzl) -Ser (Bzl) -〇Bzl，Boc-Arg(NO〗）-Gly-Asp (OBzl) -Phe-〇B zl, Boc-Arg (N02)-Gly-Asp (OBzl)-Val-〇Bzl；
[0015] (7)在冰浴下氯化氢的乙酸乙酯溶液（4M)中，Boc-Arg (N02) -Gly-Asp (OBz l)-Ser(Bzl) -OBzl, Boc-Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-〇Bz 1, Boc-Arg (N02) -Gly-A sp (OBzl)-Val-〇Bzl分别脱除Boc得到Arg(N02)-Gly-Asp (OBzl)-Ser (Bzl)-OBzl, Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Phe-〇Bzl, Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Val-〇Bzl；
[0016] (8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-羧酸在无水THF中分别与Arg(N02)-Gly_Asp(0Bzl)-Ser(Bzl)-0Bzl， Arg(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Phe-0Bzl，Arg(N02)-Gly-Asp(0Bzl)-Val-0Bzl生成1-(4-轻 基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔啉-3-甲酰-Arg (N02) -Gly-Asp (OBzl) -Ser (Bzl) -OBzl， 1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02)_Gly-Asp(0Bzl)-Phe-0Bzl， 1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02)_Gly-Asp(0Bzl)-Val-0Bzl ;
[0017] (9)在Pd/(^PH2存在下，在甲醇中1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-甲醜-Arg(Ν02)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBz1，1_(4_ 羟基-3-甲氧撰基苯 基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-〇Bzl，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯 基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg(N02) -Gly-Asp(OBzl) -Val-〇Bzl分别生成化合物 1- (4-羟 基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯 基）-β-咔琳-3-甲醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_ (4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Val。
[0018] 本发明的第三个内容是测定1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 琳-3-甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羟基-3-甲氧撰基苯基）-β-咔琳-3-甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羟基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 的纳米结构。
[0019] 本发明的第四个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羟基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 抑制肿瘤细胞增殖的作用。
[0020] 本发明的第五个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羟基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长作用。
[0021] 本发明的第六个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羟基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 抑制肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。
[0022] 本发明的第七个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羟基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 的抗炎作用。
[0023] 本发明的第八个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）_β-咔 琳_3_甲醜-Arg-Gly-Asp-Ser，1_(4_羟基_3_甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_甲 醜-Arg-Gly-Asp-Phe，1_(4_羟基_3_ 甲氧撰基苯基）-β-咔琳_3_ 甲醜-Arg-Gly-Asp-Val 的体外抗血小板聚集和体内抗栓作用。
【附图说明】
[0024] 图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨 基酸或甘氨酸。
[0025] 图2.化合物5a_c的合成路线·i)CH30H，浓H2S04,微波90°C;ii)多聚磷酸，苯甲 醇，油浴 75°C;iii)CH2Cl2,TFA;iv)THF，DDQ;v)CH30H，Pd/C，H2 ;vi)DCC，HOBt，NMM，THF; vii)CH30H，2NNaOH;viii)氯化氢 / 乙酸乙酯溶液（4N). 4a-c中AA分别为Ser(Bzl)，Phe 和Val残基；5a-c中AA分别为Ser，Phe和Val残基。
[0026] 图3.化合物5a_c在纯水溶液中1X10 7M浓度下的透射电镜照片。
[0027] 图4.化合物5a作用于肿瘤细胞的细胞活力图（η= 3)。
[0028] 图5.化合物5b作用于肿瘤细胞的细胞活力图（η= 3)。
[0029] 图6.化合物5c作用于肿瘤细胞的细胞活力图（η= 3)。
【具体实施方式】
[0030] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0031] 实施例1制备5-甲酰水杨酸甲酯
[0032] 称取1. 660g(10. 0mmol)5_甲酰水杨酸于微波反应罐中，加入25mL甲醇及lmL浓 H2S04，于微波反应器中90°C反应2h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降至室温后， 将反应液转移至lOOmL茄形瓶中，用浓氨水调pH值至7-8,将反应液减压浓缩至干后，加大 量乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯层依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍，然后用无水Na2S04干 燥2h，过滤、减压浓缩至干，于室温放置过夜即有晶体析出，得1.635g(90.8% )目标化合 物，为淡黄色针状晶体。ESI-MS(m/e) :181[M+H]+。
[0033] 实施例2制备L-色氨酸苄酯
[0034] 称取15. 0g(44. 4mmol)多聚磷酸于500mL爺形瓶中，加入80mL苯甲醇，使其在油 浴50°C中溶解，待溶液温度上升至75°C后，称取10g(49.Ommol)L-色氨酸加入其中，75°C下 反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温后，在冰浴搅拌下往反应瓶中倒入 400mL无水乙醚，此时有白色固体析出，搅拌过夜后将之过滤，白色固体用200mL乙酸乙酯 和10mL水悬浮，用三乙胺调溶液pH值至8左右，溶液变为澄清状，静置分液，将分离的酯层 依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍，乙酸乙酯层用无水Na2S04干燥2h，过滤、减压浓缩 至干，得12.85g(89.2%)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e) :295[M+H] +。
[0035] 实施例3制备1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸 节酯（1)
[0036] 往250mL茄形瓶中加入lOOmLCH2C12及10mLTFA，搅拌均匀后称取 11. 76g(40.Ommol)L-色氨酸节酯和7. 92g(44. 0mmol)5-甲酰水杨酸甲酯加入其中，数分 钟后反应液变为微红色，2天后反应液变为黑色，在冰浴搅拌下缓慢滴加浓氨水将反应液 调pH值至8,将反应液静置分液，将分离CH2C12层依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍， CH2C12层用无水Na2S04干燥2h，过滤、减压浓缩至干，得14. 59g(80% )目标化合物，为黄色 固体。ESI-MS(m/e) :457[M+H]+。
[0037] 实施例4制备1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧