聚阳离子包合物，其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种聚阳离子包合物，具体涉及一种聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修 饰β-环糊精-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷两嵌段主客体聚阳离子包合 物，及其合成方法，及由上述聚阳离子包合物制备的具有双重酸敏感性的阳离子胶束和制 备方法。本发明还涉及将该双重酸敏感性的阳离子胶束用于核酸药物输送的应用，主要用 于逆转癌细胞多药耐药或抑制癌细胞转移。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤（癌症）具有治愈率低、复发率和死亡率双高的特征，已成为威胁人类健 康的重大疾病之一。近年来，以癌症分子生物学为基础的核糖核苷酸（RNA)干扰疗法为癌 症治疗注入了新的活力。RNA干扰（RNAi)疗法可在分子水平抑制与癌症耐药或转移相关 的基因表达，从而逆转癌症耐药或抑制癌症转移。但是，目前，RNAi疗法的主要问题在于， 如何将siRNA有效地传递进入靶细胞。目前主要应用的病毒载体能够使携带的siRNA高效 的转染进入细胞，但是缺点在于，会对宿主细胞产生免疫反应，甚至产生潜在的致癌性。而 应用纳米技术的非病毒载体可提高药物稳定性，增加药物对生物膜的黏附性，提高药物靶 向输送能力，控制药物的释放并改变药物途径，已在治疗转移和耐药性癌症方面受到了广 泛关注并取得了显著成效，但是其问题在于其转染效率远远低于病毒载体。例如中国专利 CN102030898A公开了一种ABC型两亲性可生物降解聚酯三嵌段共聚物，该三嵌段共聚物可 在水中自组装形成球形纳米粒，用于疏水药物和脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸等核酸药物 的共输送。中国专利CN1281355A公开了一种基于基因递送的生物可降解性混合聚合胶束， 其载体可控制包载基因纳米颗粒的大小和电荷密度，提高了基因递送效率。然而，上述载体 缺少对细胞内外不同酸性环境的选择性，当用于核酸药物输送时，难以满足细胞外稳定存 在、细胞内快速解离并释放被包载核酸药物的要求，其应用范围和使用效果都受到了严重 限制。因此，当前仍需要不断寻找新的可将基因传递进入细胞的特异性的纳米载体。
【发明内容】
[0003] 基于以上背景，本发明的一个方面是提供了一种聚阳离子包合物，其为聚甲基丙 烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精-胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷，所述 聚阳离子包合物由式Α所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式Β所示 的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷经主客体络合作用而成，
[0004]
[0005] 其中，&~R7中的任意2~5个
其余为氢，η为1-100的整 数，优选5-30的整数；m为1-100的整数，优选1-20的整数；a为0-10的整数，优选0-4的 整数。
[0006] 所述聚阳离子包合物的具体结构尚不完全明确，但是据推断，其可以具有大致如 图6所示的由式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式B所示的胺 基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷经络合作用形成的如Α-Β所示的结构。
[0007] 本发明的另一方面涉及制备上述聚阳离子包合物的一种中间体，其为式Α所示的 聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精，
[0008]
[0009] 其中，&~R7中的任意2~5个为
其余为氢，m为1-100的整 数，优选1-20的整数。
[0010] 本发明的式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精可以通过对 β-环糊精进行修饰得到。
[0011] 本发明的又一方面涉及制备上述聚阳离子包合物的另一种中间体，其为式Β所示 的胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷，
[0012]
[0013] 其中，η为1-100的整数，优选5-30的整数；a为0-10的整数，优选0-4的整数。
[0014] 本发明式B所示的所述胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷可以通过 对金刚烷甲醇进行修饰得到。
[0015] 本发明的另一方面是提供一种制备上述聚阳离子包合物的方法，该方法包括混合 式A所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精和式B所示的胺基化聚甲基丙 烯酸缩水甘油酯修饰的金刚烷以发生络合作用的步骤。更具体而言，所述方法可以如下进 行：将胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰金刚烷溶于去离子水中，再加到聚甲基丙烯酸 二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精的盐酸溶液中发生络合作用得到目标产物。所述方法还可 以进一步包括分离纯化根据本发明的聚阳离子包合物的步骤。所述分离纯化可以采用，例 如，超滤、透析等方法进行，但不限于此。例如，可以用去离子水透析24小时后冷冻干燥得 到根据本发明的聚阳离子包合物。
[0016] 本发明的另一方面是提供一种制备式Α所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修 饰β-环糊精的方法，所述方法包括如下步骤：
[0017] (1)将β-环糊精进行修饰得到适合进行活性聚合的β-环糊精引发剂；
[0018] (2)将上述β-环糊精引发剂与甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体进行活性聚合得 到聚甲基二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精。
[0019] 在上述制备式Α所示的聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰的β-环糊精的方法 中，所述活性聚合的方法没有特殊限制，只要能够得到本发明的目标产物即可，例如，其可 以为活性自由基聚合，例如原子转移自由基聚合。
[0020] 在一个优选实施方式中，采用原子转移自由基聚合来合成式Α所示的聚甲基丙烯 酸二异丙氨基乙酯修饰环糊精，具体步骤如下：
[0021] 步骤a:β-环糊精引发剂的合成
[0023] 将β-环糊精与溴代烷基酰溴试剂经酯化反应得到β-环糊精引发剂；
[0024] 其中，Rs~R14中的任意2~5个
[0025] 所述反应可以在有机溶剂和有机碱存在下进行，所述有机溶剂可以为N，N-二甲 基乙酰胺，所述有机碱可以为三乙胺。优选地，所述反应步骤为：将β-环糊精溶于N，N_二 甲基乙酰胺中以使终浓度为5-20W/V，向溶液中加入无水三乙胺，称取2-溴异丁基酰溴并 将其溶于无水二氯甲烷，冰浴下将2-溴异丁基酰溴滴加到β-环糊精溶液中，滴加结束后 反应24小时，用乙醚沉淀反应产物并用丙酮冲洗后旋蒸，得到溴封端的β-环糊精引发剂。
[0026] 在上述反应中，三乙胺与β-环糊精的摩尔比=1:1至5:1，优选2:1。2-溴异丁 基酰溴与β-环糊精的摩尔比=2:1至5:1，优选4:1。
[0027] 步骤b:聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯修饰β-环糊精的合成
[0029] 将步骤a中得到的β_环糊精引发剂与甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯单体混 合，在原子转移自由基聚合催化剂配体及催化剂存在下发生聚合得到聚甲基丙烯酸二 异丙氨基乙酯修饰的环糊精，其中，RS~R14中为
的基团经上述反应成为
基团，其余的r8~r14仍为氢。
[0030] 在上述反应中，所述溶剂、原子转移自由基聚合催化剂和催化剂配体可以为本领 域中常用的溶剂、催化剂和催化剂配体；其中，β-环糊精引发剂与甲基丙烯酸二异丙 氨基乙酯单体的比例为1:30至1:200 ;且优选地，所述溶剂为体积比=10:1至1:10的 Ν，Ν_二甲基乙酰胺-异丙醇混合溶剂；所述催化剂配体为五甲基二乙烯三胺，其用量为 β-环糊精大分子引发剂的4倍摩尔比；所述催化剂为溴化亚铜，其用量与催化剂配体等摩 尔比；所需反应温度为30-90°C之间的任意温度，优选40-60°C。反应时间为1-24小时。
[0031] 本发明的另一方面是提供一种阳离子胶束，所述阳离子胶束包括根据本发明的聚 阳离子包合物，其优选由根据本发明的聚阳离子包合物形成，其中，所述阳离子胶束包括胺 基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯阳离子化亲水外层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯疏水内 层。
[0032] 所述阳离子胶束具有双重酸敏感性，其亲水外层可在pH为7. 4的中性生理条件下 结合质子显正电性，胶束的疏水内层可在pH低于6. 3的弱酸性环境中结合质子解离。所述 阳离子胶束的平均流体力学粒径优选为20-200纳米。
[0033] 本发明的另一方面是提供一种所述阳离子胶束的制备方法，其特征是：将根据本 发明的聚阳离子包合物溶解于1-5倍体积酸性缓冲溶液中，将该溶液在超声下滴入10-50 体积碱性缓冲液中，经超滤法或透析法纯化后得到所述阳离子胶束溶液，其中，酸性缓冲液 的pH值为1. 0-5. 0,碱性缓冲液的pH值为8. 0-12. 0。
[0034] 本发明由聚阳离子包合物通过溶液自组装方法制备的阳离子胶束具有核壳结构， 包括胺基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯阳离子化亲水外层和聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯 疏水内层，阳离子胶束的平均流体力学粒径优选为20-200纳米，更优选为20-60纳米。
[0035] 所述阳离子胶束的疏水核层和水化外层具有不同功能，使相应的阳离子胶束具备 多功能性。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯经乙二胺或其寡聚物胺基化后带有一级胺和二级胺， 该嵌段具有强质子缓冲能力，在中性生理条件下带正电性，可通过静电作用吸附负电性核 酸药物。聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯嵌段具有酸敏感性（pKa6. 3)，在中性生理条件下具 有疏水性，构成阳离子胶束的疏水内核。聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯内核在细胞弱酸性 环境中解离，快速释放被包载药物。所述阳离子胶束具有在pH= 4. 5-6. 0和6. 0-9. 0两个 区间的酸敏感性。
[0036] 本发明的又一方面是提供一种负载有核酸的阳离子胶束复合物，其包括：根据本 发明的阳离子