一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法，属于微生物遗传和 分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在1974年被国际癌症 研究机构（IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现氨基甲酸乙酯也可以直 接诱发人的肝癌，进一步促使IARC在2007年将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B级提升到了 2A级（与甲醛同级）。而黄酒中的氨基甲酸乙酯，已经成为危害消费者健康和影响其市场 竞争力的重要隐患。
[0003] 在清酒和黄酒中，由酿酒酵母代谢产生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前体物 质。在发酵过程中，酵母细胞内的尿素主要由精氨酸代谢产生。当发酵培养基中无酵母偏 好型氮源（谷氨酰胺、天冬酰胺等）存在时，尿素可以进一步被尿素水解酶降解为二氧化碳 和氨。但当酵母偏好型氮源存在时，尿素水解酶的表达会受到强烈的抑制。这种现象由酿 酒酵母的氮源阻遏效应（Nitrogencataboliterepression，简称NCR)调控，可以保证酵母 细胞能在复杂的生存环境中优先利用最利于其生存的氮源。NCR效应的调控会导致酵母细 胞内高浓度尿素的积累。由于尿素对酿酒酵母细胞有毒害作用，因此细胞通过尿素透性酶 以主动运输的方式将尿素转运至胞外。在胞外的发酵液中，尿素可以在发酵的过程中自发 的和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯。
[0004] NCR效应相关的全局性调控因子主要有：四个GATA家族调控因子（Gln3p、Gatlp、 Gzf3p和Dal80p)和Ure2p。其中Gln3p和Gatlp是正调控因子，Gzf3p和Dal80p是负调控 因子，而Ure2p则是一个可以与Gln3p和Gatlp相结合的阻遏蛋白。在酿酒酵母中，Gln3p 和Gatlp能否发挥其功能与它们在胞内的定位密切相关，只有当这两个激活因子被转运至 细胞核内时，它们才能激活尿素代谢相关基因的表达。对这两个调控因子胞内定位的调控 与它们蛋白序列上的核定位序列和核定位调控序列密切相关。Gln3p和Gatlp的核定位序 列和核定位调控序列是酿酒酵母NCR效应重要的调控开关。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的问题是提供一种通过改造酿酒酵母氮代谢物阻遏效应调控因子， 减少黄酒发酵中氨基甲酸乙酯或尿素积累的方法。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种可减少黄酒发酵中氨基甲酸乙酯或尿素积累的 方法，所述方法是使用酵母基因工程菌进行发酵；所述酵母基因工程菌的氮代谢物阻遏效 应相关调控因子Gln3p和Gatlp是进行了改造的。
[0007] 所述改造是消除了调控因子Gln3p和Gatlp的核定位调控序列并突变了核定位序 列上的磷酸化位点。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述改造包括将氨基酸序列为SEQIDNO. 1的Gln3p 的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第347位和第355位的丝 氨酸突变为丙氨酸。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述改造还包括将氨基酸序列为SEQIDN0. 2的 Gatlp的位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸 突变为丙氨酸。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将改造后的Gln3p和Gatlp基因 片段先后连接到表达载体上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主酵母中进行表达。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是PY26-GPD-TEF。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述pY26-GPD-TEF的核苷酸序列如SEQIDN0. 25 所示。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主酵母是酿酒酵母。
[0014] 本发明的第二个目的是提供了一种酵母基因工程菌。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将改造了的Gln3p和Gatlp基因 片段连接到同一表达载体后在转化到宿主酵母中得到的；所述改造包括将氨基酸序列为 SEQIDNO. 1的Gln3p的位于654-667位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第344位、第 347位和第355位的丝氨酸突变为丙氨酸，还包括将氨基酸序列为SEQIDN0. 2的Gatlp的 位于376-510位氨基酸的核定位调控序列消除，并将第360位和第361位的丝氨酸突变为 丙氨酸。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是PY26-GPD-TEF。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主是酿酒酵母N85单倍体菌株。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建方法具体是：（1)对Gln3p 和Gatlp的核定位调控序列进行消除：将相应截短后的基因连接到表达载体pYX212,得 到重组质粒pYX212-Gln3Pl653和pYX212-Gatlp1375; (2)对Gln3p和Gatlp的核定位序列 上的磷酸化位点进行突变：分别将质粒pYX212-Gln3Pl653和pYX212-Gatlp1375上的GLN3 和GAT1基因相应磷酸化位点基因突变，得到重组质粒pYX212-Gln3Pl653,, S344A,s347A, S355A和 pYXSI^-GatlPi375,S360A,s361A; (3)将Gln3p! 653,S344A,s347A,S355A^PIGatlp! 375,S360A,s361A分力lj先后亚 克隆至载体pY26_GPD_TEF上，获丫守重组质粒pY^-Glr^Pi375,S36CIA,s3 61A，并转化酿酒酵母N85单倍体菌株。
[0019] 本发明所述的减少氨基甲酸乙酯的积累，指的是基因工程菌株相对于野生菌株， 在黄酒发酵过程中积累氨基甲酸乙酯的情况。
[0020] 本发明的有益之处：本发明对酿酒酵母氮代谢物阻遏效应相关调控因子进行了遗 传改造，使黄酒发酵中氨基甲酸乙酯的含量下降了 72%，下降至55. 53μg/L左右，远低于 了发达国家的限量标准。该方法的效果已经超过了绝大多数减少氨基甲酸乙酯方法的效 果，完全可以满足黄酒生产的要求。除此之外，该代谢工程改造方法并未对菌株的发酵特性 造成影响，所构建的基因工程菌株有应用于黄酒生产的巨大潜力。
【具体实施方式】
[0021] 氨基酸乙酯的检测方法参考文献：LecaJM,PereiraV，PereiraAC,Marques JC.Rapidandsensitivemethodologyfordeterminationofethylcarbamatein fortifiedwinesusingmicroextractionbypackedsorbentandgaschromatography withmassspectrometricdetection.AnalyticaChimicaActa811,29-35(2014))；
[0022] 尿素和氨基酸的检测方法参考文献：
[0023] (l)KnorstMT,NeubertR,ffohlrabff.Analyticalmethodsformeasuring ureainpharmaceuticalformulations.JournalofPharmaceuticalandBiomedical Analysis15,1627-1632(1997)
[0024] (2)KandaJ.Determinationofammoniuminseawaterbasedonthe indophenolreactionwitho-phenylphenyl(0ΡΡ).WaterResearch29,2746-2750(1995)
[0025] (3)CigicIK,VodosekTV,KosmerlT,StrlicM.Aminoacidquantificationin thepresenceofsugarsusingHPLCandpre-columnderivatizationwith3-MPA/OPA andFM0C-C1.ActaChimicaSlovenica55,660-664(2008)；
[0026] 发酵液中风味物质的检测方法参考文献：
[0027]CaoY,XieGF,ffuC,LuJA.Astudyoncharacteristicflavorcompounds intraditionalChineseric