可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于菌剂及应用，主要涉及一种用于氯嘧磺隆污染土壤生物修复的复合菌剂。
【背景技术】
[0002]氯啼磺隆(也称豆磺隆，chlorimuron-ethyl)是20世纪80年代美国杜邦公司开发的一种磺酰脲类除草剂，具有杀草谱广、超高活性、高选择性、可混性强等特点。自20世纪90年代大面积使用以来，氯嘧磺隆一直是大豆田化学除草的主要品种，在我国东北地区广泛使用。氯嘧磺隆在土壤中残效期长，可达2-3年，属长残效除草剂。长残效除草剂连续多年的使用可在土壤中持续积累，在连作或轮作农田中造成后茬敏感作物的减产或绝产，影响农业种植结构的调整及土壤资源的可持续利用。
[0003]目前，减轻甚至解除土壤中磺酰脲类除草剂污染的途径主要有化学水解和微生物降解两个途径，其中微生物修复作用显著。因此，筛选出氯嘧磺隆高效降解菌株，对于氯嘧磺隆污染土壤的生物强化修复具有重要意义。当前国内外报道的对氯嘧磺隆有降解作用的微生物主要有主要有假单胞菌属、酿酒酵母、寡养单胞菌属、克雷伯氏菌属、掷孢酵母属。虽然以上筛选菌株在实验室无菌条件下对氯嘧磺隆具有比较良好的效果，但是释放到环境土壤中是否能够存活、具有降解效率有待深入的研究。截止目前，氯嘧磺隆强化生物修复菌剂的研究尚无报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就在于提供一种具有可高效降解土壤中残留氯嘧磺隆功能的复合菌剂，使微生物种群间具有良好的协同支持作用，对土壤中残留氯嘧磺隆具有高效稳定的降解能力，达到高效降解土壤中残留氯嘧磺隆的目的。
[0005]本发明的目的是这样实现的:可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂，所述复合菌剂由红平红球菌Rhodococcus erythropolis和肠杆菌Enterobacter sp.在菌液浓度相同时，按照体积比例1:1组成。将所述可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂用于被氯嘧磺隆污染土壤的生物修复。
[0006]可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂采用生物技术，菌种取自于土壤而用之于土壤，适应环境能力极强，在条件适宜情况下，即可大量繁殖且发挥降解氯嘧磺隆的作用，从而消除氯嘧磺隆对后茬作物的影响。该菌剂配伍简单，生产成本低廉，降解效果和土壤修复质量好，提高土壤酶活力，使用方便，有利于生态环境保护和绿色农产品生产。土壤中施用该菌剂30d后对氯嘧磺隆降解率达到82.16%以上。
【附图说明】
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[0007]图1、可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂对土壤中氯嘧磺隆降解的影响曲线；
[0008]图2、可高效降解菌剂制备前期液体培养过程中外加碳源的优化；
[0009]图3、复合菌剂制备前期液体培养过程中碳源浓度的优化；
[0010]图4、复合菌剂制备前期液体培养过程中培养温度的优化；
[0011]图5、复合菌剂制备前期液体培养过程中pH的优化；
[0012]图6、混合菌在种子培养基中的生长曲线；
[0013]图7、复合菌剂制备过程中菌剂载体种类的优化；
[0014]图8、复合菌剂制备过程中营养液加入量的优化；
[0015]图9、复合菌剂制备过程中菌液接种量的优化；
[0016]图10、复合菌剂制备过程中培养温度的优化。
【具体实施方式】
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[0017]下面对本发明实施方案进行详细说明。
[0018]—种可高效降解氯啼磺隆的复合菌剂，所述复合菌剂由红平红球菌Rhodococcuserythropolis和肠杆菌Enterobacter sp.在菌液浓度相同时，按照体积比例1:1组成。将所述可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂用于被氯嘧磺隆污染土壤的生物修复。用于被氯嘧磺隆污染土壤生物修复的优选应用方法是:将按重量百分比为1%比例的可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂散施于氯啼磺隆浓度为50mg/kg的土壤中。
[0019]科研试验过程:
[0020]复合菌剂的制备:①将分离筛选的两种氯嘧磺隆降解菌株在菌液浓度相同时，按照体积比例1:1接种到LB液体培养基中，在30°C条件下进行摇床培养；②将培养好的LB混合菌液接种到外加碳源的无机盐液体培养基中，培养至对数期，作为种子液备用；③取3.5mL种子液接种到固体培养基中，加入3mL营养液，35°C培养2d后，放置烘箱干燥；④将干燥后的固体研磨、装瓶，即获得具有高效降解氯嘧磺隆的微生物菌剂。其中步骤②所用液体发酵培养基由 NaCl、KH2P04、K2HP04、MgS04、(NH4)2S04、FeS04、玉米粉和 lOOOmL 的蒸馏水所组成，pH 7 ;步骤③中的固体培养基由麦麸、草炭和营养液所组成；麦麸与草炭的比例为 1: 1，营养液由葡萄糖 7g，Κ2ΗΡ040.7g，MgS04.7H20 0.4g，KH2P040.8g，NaCl 0.4g，蒸馏水lOOOmL组成，pH自然。
[0021]菌剂制备前期液体培养条件优化:①菌剂制备前期液体培养过程中外加碳源的优化:分别选取玉米粉、蔗糖、可溶性淀粉、柠檬酸、葡萄糖各10g为无机盐培养基的外加碳源，将两种氯嘧磺隆降解菌株按1:1接种到无机盐培养基中，在30°C条件下进行摇床培养Id后测定每毫升菌液中的有效活菌数和降解率；②菌剂制备前期液体培养过程中外加碳源的优化:将最优碳源设置五个浓度，分别以5g/L、7g/L、9g/L、llg/L、13g/L的浓度加入无机盐培养基，在30°C条件下进行摇床培养Id后测定每毫升菌液中的有效活菌数和降解率；③菌剂制备前期液体培养过程中培养温度的优化:温度设5个梯度28°C、30°C、32°C、34°C、36°C，接入降解菌后摇床培养Id后，测定每毫升菌液中的有效活菌数和降解率菌剂制备前期液体培养过程中pH的优化，pH设6个梯度5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，接入降解菌后摇床培养Id后，测定每毫升菌液中的有效活菌数和降解率。结果见图1、图2、图3及图4。
[0022]复合菌剂的降解能力优化:①菌剂载体种类的优化:选取麦麸、草炭两载体，并将麦麸和草炭分别以1:4、2:3、1:1、3:2和4:1的比例分装在养皿中，装量皆为5g，加入3mL营养液，pH自然，搅匀后灭菌，将培养至对数期的扩大培养液2mL接入固态培养基，35°C恒温培养箱中静置培养2d，取出后40°C恒温干燥，研磨，取样测定每克菌剂中的有效活菌数和氯嘧磺隆降解率营养液加入量的优化:调整加入固态培养基中的营养液量，2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL，于35°C静置培养2d，取出40°C恒温干燥，研磨，取样测定每克菌剂中的有效活菌数和降解率；③菌液接种量的优化:在以上最优结果的基础上，调整菌接入固态培养基中的菌液量，2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL，于35°C静置培养2d，取出40 °C恒温干燥，研磨，取样测定每克菌剂中的有效活菌数和降解率；④菌剂制备过程中培养温度的优化:培养温度设6个梯度26°C、28°C、30°C、32°C、34°C、36°C静置培养2d，取出40°C恒温干燥，研磨，取样测定每克菌剂中的有效活菌数和降解率。结果见图5、图6、图7、图8及图9。
[0023]氯嘧磺隆复合降解菌剂的应用试验:首先称取土壤1000g，加入由氯嘧磺隆原药制成的水溶液，使土壤中氯嘧磺隆的浓度为50mg/kg(即配制成被氯嘧磺隆污染的土壤)，然后按重量百分比为0.1%比例，将生物修复菌剂散施于土壤中，充分混合，放于25°C的暗培养箱中恒温培养30d，分别在5、10、15、20、25、30d取样测定氯嘧磺隆降解率。结果见图10。
【主权项】
1.一种可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂，其特征在于:所述复合菌剂由红平红球菌Rhodococcus erythropolis和肠杆菌Enterobacter sp.在菌液浓度相同时，按照体积比例1:1组成。2.如权利要求1所述的可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂应用，其特征在于:将所述可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂用于被氯嘧磺隆污染土壤的生物修复。3.根据权利要求2所述的可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂应用，其特征在于:用于被氯嘧磺隆污染土壤生物修复的优选应用方法是:将按重量百分比为1%比例的可高效降解氯啼磺隆的复合菌剂散施于氯啼磺隆浓度为50mg/kg的土壤中。
【专利摘要】可高效降解氯嘧磺隆的复合菌剂及应用属于菌剂及应用技术；所述复合菌剂由红平红球菌和寡养单胞菌在菌液浓度相同时，按照体积比例1：1组成，并将其用于土壤生物修复，减少和消除土壤中残留的氯嘧磺隆；本菌剂配伍简单，生产成本低廉，降解效果好，土壤修复质量好，使用方便，有利于生态环境保护和绿色农产品生产。
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20, B09C1/10
【公开号】CN105274036
【申请号】CN201510869019
【发明人】李春艳, 成小松, 李大鹏, 臧海莲, 吕彤阳, 成毅, 刘科然, 安雪姣, 刘婉君, 杜小鹏, 蓝传增, 徐翩翩
【申请人】东北农业大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年12月1日