一种可降解人iPSCs源性视网膜神经支架及其制作方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于干细胞和视网膜组织工程领域，具体涉及一种可降解人iPSCs源性视网膜神经支架及其制作方法。
【背景技术】
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[0002]视网膜神经元的损伤和修复是神经性视觉损伤发生、发展和转归共同的科学问题。近年随着干细胞研究的迅速发展，诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcells, iPSCs)为视觉神经损伤的修复与治疗带来了新的希望。由于iPSCs自我复制和多分化潜能，作为修复神经系统损伤的供体不但能满足移植时所需的细胞量，而且iPSCs在一定条件下能诱导分化为包括神经元在内的不同的神经细胞系。因此，利用人源性iPSCs移植治疗视觉神经损伤疾病具有重要的理论意义和良好的临床治疗前景。目前，iPSCs替代治疗主要通过以下两个途径:1.干细胞移植入视网膜下腔/玻璃体腔；2.干细胞体外分化为视网膜神经元移植入视网膜下腔/玻璃体腔。研究发现将iPSCs细胞直接移植到受损的视网膜组织后，90%以上的细胞均分化为星形胶质细胞，几乎没有神经元的存在；而应用iPSCs诱导分化的神经元与宿主视网膜整合性较差。因此，如何将人iPSCs源性视网膜神经元体外培养，并将其较好地移植整合入宿主网膜，是当前干细胞治疗与神经再生领域的难点问题。
【发明内容】
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[0003]本发明的目的是提供一种可降解人iPSCs源性视网膜神经支架及其制作方法。
[0004]本发明的可降解人iPSCs源性视网膜神经支架是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤:
[0005]在与内眼形状相适应、网状、可降解的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)支架上包被基质胶Matrigel，形成Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架，将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接种至Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架上，然后置于诱导分化培养基中进行培养，种子细胞在支架上定向分化成视网膜神经细胞，从而形成可降解人iPSCs源性视网膜神经支架(iRMP)，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子(bFGF、CNTF、BDNF)和维持浓度的视网膜分化营养液(RDM)组成的培养基。
[0006]所述的诱导分化培养基优选为:每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement lng、非必须氨基酉爱(essential media-non essential amino acidsNEAAs) lng、肝素2 μ g，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1:1混合而成。
[0007]bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，BDNF为脑源性神经营养因子，CNTF为亲胆喊能神经元因子，N2supplement 为 N2 添加剂，essential media-non essential aminoacids (NEAAs)为非必须氨基酸，heparin为肝素，它们都是现有技术中的物质。
[0008]所述的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)支架，其孔隙率80%，孔径40 μ m、厚度60 μm，直径4mm，表面积为12.56mm2的圆形支架。
[0009]所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞优选为将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。
[0010]所述的培养优选是在37°C、5% C02，饱和湿度下进行培养。
[0011]本发明是将人iPSc源性的3D视网膜神经纤维层组织种子细胞种植在可降解Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架上定向诱导分化，成功构建一种可降解人iPSCs源性视网膜神经支架(iRMP)。本发明将干细胞与组织工程技术相结合，对干细胞与再生医学的基础研究及眼科学临床治疗均有一定的理论和实际应用价值，对视神经系统的损伤修复以及神经组织工程学的研究亦产生积极的推动作用。
[0012]本发明通过将人iPSCs源性视网膜神经组织来源的种子细胞在经基质胶(Matrigel)包被的可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)支架上培养诱导分化，制作成可降解人iPSCs源性视网膜神经支架(iRMP)。该iRMP经证明具有功能性动作电位，并在动物眼内证明有较好的整合功能。本发明为干细胞联合组织工程移植治疗视觉损伤奠定了理论和实验基础。
【附图说明】
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[0013]图1是电镜示PLGA支架孔径50 μ m、厚度60 μ m ;
[0014]图2是Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架，直径4mm，表面积为12.56mm2；
[0015]图3是种子细胞于Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架共培养7天后可见细胞周围出现较长突起，形态上类似神经元细胞；
[0016]图4是Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架上神经轴突生长显著优于对照组，其中PLGA表示本发明的将种子细胞接种至Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架上于诱导分化培养基中培养，Coverslip表示将种子细胞接种至载玻片上于诱导分化培养基中培养，Transwell表示将种子细胞接种至聚碳酸酯膜上于诱导分化培养基中培养；
[0017]图5是iRMP生长14天后的细胞抗体Brn3b(A)，HuD(B)及Tjul (C)免疫荧光染色；
[0018]图6是应用膜片钳技术检测iRMP的动作电位结果；
[0019]图7是iRMP移植入兔眼后与网膜整合良好。
【具体实施方式】
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[0020]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0021]实施例1:
[0022]—、获得可降解聚丙交酯共聚乙交酯(PLGA)支架:
[0023]将PLGA(摩尔比50:50，分子量为80kg/mol)溶解于二氯甲烷中，然后加入到1，1，1,3, 3，3-六氟异丙醇中，在25°C环境中，搅拌将PLGA聚合物溶解在1，1，1,3, 3，3-六氟异丙醇中配制成浓度为50wt%的纺丝(聚合物溶液，静电纺丝参数:聚合物溶液流速为0.8-1.0ml/h，纺丝电压为20kv，纺丝距离100mm);将聚合物溶液装入10ml的注射器中，注射针内径0.4_;注射器与注射栗连接，接收端装置为覆盖有四氟乙烯纤维膜，转速4000-5500rpm的转筒(直径100mm，长度300mm);支架在25°C下真空干燥48h彻底去除溶剂，获得孔径50 μ m、厚度60 μ m的PLGA支架(图1)。
[0024]二、制作符合内眼移植要求的Matrigel-PLGA细胞共培养支架:
[0025]基于内眼移植要求，将PLGA支架制备为孔径50 μ m、厚度60 μ m，直径4mm，表面积为12.56mm2的圆形支架(图2)，即为PLGA内眼移植支架。经钴60辐照灭菌后，得到无菌的PLGA内眼移植支架；将基质胶Matrigel (BD)溶解于PH为7.2的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，获得浓度为质量分数10%的Matrigel溶剂；将10%的Matrigel溶剂包被于PLGA内眼移植支架上，在4°C条件下静置24h，形成Matrigel-PLGA内眼移植/细胞共培养支架。
[0026]三、制作可降解人iPSCs源性视网膜神经支架(iRMP):
[0027]采用机械分离的办法，将培养50-55天的人iPSc源性的3D视网膜(具体制备方法参考文南犬:X