抗gata3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗gata3单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产 生的抗GATA3单克隆抗体和应用。
【背景技术】
[0002] GATA3结合蛋白通常简称GATA3,是GATA家族中的多功能转录因子，与乳腺上皮、 尿道上皮、表皮、皮肤附属器以及T细胞亚群的发育和功能密切相关，是乳腺和尿道移行细 胞肿瘤敏感但不特异的标记物。GATA3阳性的上皮性肿瘤还包括基底细胞癌、皮肤鳞癌、皮 肤附属器肿瘤、绒癌、内胚窦瘤、肾嫌色细胞癌、恶性间皮瘤、涎腺和胰腺导管腺癌，除此以 外的大多数癌阳性表达〈10%。由于GATA3很少表达于神经外胚层和间叶性肿瘤，除外嗜铬 细胞瘤/副神经节瘤，因此有助于与神经内分泌肿瘤的鉴别诊断。
[0003] 目前临床上主要通过免疫组织化学（IHC)病理实验检测肿瘤组织中GATA3蛋白的 表达状况。IHC实验的核心为特异性结合GATA3蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定 着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对GATA3蛋白的单 克隆抗体具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗GATA3单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与GATA3蛋白的结合特异 性并应用到相关产品的制备中。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNo. 11087。
[0007] 本发明所述抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：
[0008] (1)重组表达载体的构建：根据GATA30RF核苷酸序列（GATA3 0RF核苷酸序列如 SEQIDNO. 1 所示，1332bp;GATA3 氨基酸序列如SEQIDN0. 2 所示）；
[0009] 设计引物PCR扩增GATA30RF第465bp位到第1329bp位序列，基因两侧分别引入 限制性内切酶位点Sgfl和Mlul，插入表达载体pET23a-N-His(购于Origene公司），构建 GATA3的重组表达质粒pET-His-rGATA3 ;
[0010] (2)GATA3重组蛋白的表达与纯化：将GATA3重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解 离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的GATA3重组蛋白；
[0011] (3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的GATA3重组蛋白免疫BALB/c小 鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂 交瘤细胞，获得能分泌抗GATA3特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体， 通过亲和层析柱纯化获得抗GATA3单克隆抗体。分别通过WesternBlot、免疫组化实验验 证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
[0012] 同时，采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所 述单克隆抗体仅和GATA3蛋白特异性结合，而与近10000种其他蛋白无交叉反应。
[0013] 经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗GATA3单克隆抗体的杂交瘤细胞， 命名为0TI5C11，亚型鉴定为IgG2b，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所，保藏编号为CGMCCNo. 11087。
[0014] 同时，本发明还提供一种抗GATA3蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No. 11087的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗GATA3蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方 法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水。
[0015] 本发明所述保藏编号为CGMCCNo. 11087的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的 抗GATA3蛋白单克隆抗体为IgG2b型，效价较高。将所述单克隆抗体于成人肾癌、膀胱癌组 织中可见到特异性细胞核染色。结果与GATA3在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表 明单克隆抗体可用于免疫组织化学检测GATA3蛋白的水平。
[0016] 因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNo. 11087的杂交瘤细胞在制备抗GATA3 蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗GATA3蛋白单克隆抗体在制备检测GATA3蛋白的 免疫检测产品中的应用。
[0017] 作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。
[0018] 本发明还提供一种检测GATA3蛋白的免疫组化检测试剂盒，包括保藏编号为 CGMCCNo. 11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒 可检测组织细胞中GATA3蛋白的表达状况。
[0019] 此外，本发明还提供保藏编号为CGMCCNo. 11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗 GATA3蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。
[0020] 本发明所述肿瘤细胞具体是指肿瘤细胞的增殖与GATA3的表达密切相关的所有 肿瘤。作为优选，所述肿瘤细胞包括以下组织细胞的肿瘤：
[0021] 乳腺、前列腺、膀胱、皮肤、肾脏、大血管上皮、淋巴细胞。
[0022] 本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗GATA3蛋白单克隆抗体，且与GATA3 蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了GATA3蛋白免疫检测的特 异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内GATA3蛋白表达水平，可应用于检测前列腺、 膀胱、肾脏、乳腺、皮肤、大血管上皮以及淋巴细胞等相关肿瘤组织中GATA3的表达水平。
[0023] 生物保藏信息说明
[0024] 0TI5C11，分类命名为GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2015年7月3日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 11087。
【附图说明】
[0025] 图1所示为实施例1中克隆位点图；
[0026] 图2所示为实施例2重组GATA3蛋白Westernblot检测结果图，以anti-His检 测重组GATA3蛋白在E.Coli细胞中的表达，其中泳道1为转染空载体的E.Coli细胞裂解 液为抗原的检测结果、泳道2为转染pET-His-rGATA3质粒的E.Coli细胞裂解液抗原的检 测结果；
[0027] 图3所示为实施例2重组GATA3蛋白SDS-PAGE结果图，用镍亲和层析柱纯化重组 GATA3蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；
[0028] 图4所示为实施例3以杂交瘤细胞0TI5C11分泌产生的单克隆抗体识别293T细 胞过表达的GATA3全长蛋白以及肿瘤细胞系MCF7内源GATA3蛋白的Westernblot检测结 果图；
[0029] 图5所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人前列腺组织免疫组化结果图 (一抗为杂交瘤细胞0TI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体），图中箭头所指为特异性细 胞核染色；
[0030] 图6所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肾癌组织免疫组化结果图（一 抗为杂交瘤细胞0TI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体），图中箭头所指为特异性细胞核 染色；
[0031] 图7所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人膀胱癌组织免疫组化结果图 (一抗为杂交瘤细胞0TI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体），图中箭头所指为特异性细 胞核染色；
[0032] 图8所示实施例5origene蛋白芯片鉴定结果图（一抗为杂交瘤细胞0TI5C11分 泌产生的抗GATA3 单克隆抗体，1:100 ;二抗为DyLight649-conjugatedAffiniPure FragmentGoat-anti-MouseIgG，1:400)。
【具体实施方式】：
[0033] 本发明公开了抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗 体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。
[0034] 下面就本发明提供的抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单 克隆抗体和应用做进一步说明。
[0035] 实施例1 :GATA3重组表达质粒的构建
[0036] 以从美国傲锐东源生物科技有限公司购得的质粒RC201618 (含GATA30RF 1332bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点Sgfl和Mlul，克隆0RF第465bp至 1329bp到表达载体pET23a-N-His，建立GATA3重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。
[0037] 实施例2 :GATA3重组蛋白的表达与纯化
[0038] 1、转化E.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀， 冰浴30min后42°C热激90s，然后将其继续冰浴l-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗 LB培养基，于37°C摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿 倒置于37°C恒温培养箱中培养过夜。
[0039] 2、裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37°C、200rpm培养至0D值达到0. 4~ 0. 6时加入IPTG(终浓度ImM)诱导培养7h。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体， 超声破碎20min后于4°C下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体做WB鉴定，见图2。
[0040] 3、镍柱亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μπι滤膜过滤后上样 并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别 收集后进行SDS-PAGE鉴定，将符合要求的洗脱蛋白合并并加入10%甘油，纯化后的重组 GATA3蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图3。
[0041] 由图2结果可见，转染pET-N-His-rGATA3质粒的Ε.coli细胞裂解液中WB检测后 在26kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明细胞中重组GATA3蛋白 特异表达。
[0042] 由图3结果可见，纯化的蛋白在PAGE胶26kD处有明显的特异条带，分子量与预期 分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的GATA3重组蛋白。
[0043] 实施例3