抗lgr5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗lgr5单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产 生的抗LGR5单克隆抗体和应用。
【背景技术】
[0002] Lgr5 (leucine-richrepeatcontainingGprotein)是近些年发现的重要 的干细胞和肿瘤干细胞标记分子，它是一个类似于促甲状腺素受体抗体（Thyrotropin receptor,TSHR)的G蛋白，他们的胞外区都有一个富含亮氨酸的重复区域，不同的是Lgr5 有18个重复，TSHR有9个重复。Lgr5最早是作为小肠的干细胞分子标记发现的，它是WNT 信号通道下游激活的基因之一，与此同时，Lgr5的配体R-spondin和Lgr5的结合也使得细 胞对WNT的刺激更为灵敏。在小肠中，遗传标记的一个Lgr5阳性的细胞可以形成整个小肠 绒毛结构；在体外培养的体系中，Lgr5的阳性细胞也可以形成多种小肠细胞和分泌腺体。 此外，Lgr5阳性细胞在正常的胃组织中也被发现具有干细胞功能，并且也是皮肤干细胞的 一种。最近的小鼠遗传标记实验证明，Lgr5的阳性细胞在突变后可以导致结肠癌，并且这 些细胞在结肠癌肿拥有肿瘤干细胞的特征。
[0003] 随着近年来人们对LGR5深入的认识及研究，发现它在不同的肿瘤疾病（如结肠 癌，胃癌，肝细胞癌，卵巢癌，皮肤基底细胞癌等）中的表达水平均有不同程度的升高。因 此，LGR5被认为具有潜在肿瘤标志物的价值，目前主要用于标记结肠癌和胃癌的肿瘤干细 胞。
[0004] 目前在科研上通常通过流式细胞术（FlowCytometry，FC)检测LGR5来标记和分 离干细胞和肿瘤干细胞，而临床上通常用免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC)病 理实验检测肿瘤组织内肿瘤干细胞中LGR5的表达状况。而不论是FC还是IHC，其实验方 法的核心为特异性结合LGR5的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度 和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对LGR5蛋白的单克隆抗体具有重要的意 义。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗LGR5单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与LGR5蛋白的结合特异性 并应用到相关广品的制备中。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCN0 :11086。
[0008] 本发明所述抗LGR5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：
[0009] (1)重组表达载体的构建：根据LGR50RF核苷酸序列（LGR5 0RF核苷酸序列如 SEQIDNO. 1所示，1566bp;LGR5氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示）设计引物进行PCR扩 增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点Sgfl和Mlul，插入表达载体pCMV6-Entry(货号PS100001，Origene公司），构建LGR5重组表达质粒；
[0010] (2)LGR5重组蛋白的表达与纯化：将LGR5重组表达质粒转化HEK293T，裂解离心取 上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的LGR5重组蛋白；
[0011] (3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的LGR5重组蛋白免疫BALB/c小鼠， 取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤 细胞，获得能分泌抗LGR5特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过 亲和层析柱纯化获得LGR5单克隆抗体。分别通过流式细胞术、免疫组化检测实验验证该单 克隆抗体的灵敏度和特异性。
[0012] 经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗LGR5单克隆抗体的杂交瘤细胞，命 名为UMAB212,亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保藏编号为CGMCCNO:11086。
[0013] 同时，本发明还提供一种抗LGR5蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNO:11086 的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗LGR5蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过 无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得LGR5单克隆抗体。
[0014] 本发明所述保藏编号为CGMCCNO:11086的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生 的抗LGR5蛋白单克隆抗体为IgG2a型，效价较高。将所述单克隆抗体于正常小肠组织和结 肠癌组织中可见到小肠组织中隐窝基底柱状上皮细胞呈特异性表达，以及结肠癌组织中的 肿瘤干细胞表达。
[0015]同时，采用流式细胞术检测本发明所述单克隆抗体，结果显示其可以特异性结合 人源和鼠源的LGR5蛋白，而不能识别鼠源LGR4和LGR6、人源的LGR4和LRG6,以及能够识 别稳定表达LGR5的295T活细胞表面的LGR5蛋白，而在对照的293T细胞上并没有检测到 相应的表达信号；采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明 所述单克隆抗体仅和LGR5蛋白特异性结合，而与近10000种其他蛋白无交叉反应。
[0016] 因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO:11086的的杂交瘤细胞在制备抗 LGR5蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗LGR5蛋白单克隆抗体在制备检测LGR5蛋白 的免疫检测产品中的应用。
[0017] 作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。
[0018] 本发明还提供一种用于流式细胞术检测和免疫组化检测的试剂盒，包括保藏编号 为CGMCCNO:11086的杂交瘤细胞分泌产生的抗LGR5蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂 盒可检测组织细胞（干细胞）中LGR5蛋白的表达状况。
[0019] 此外，本发明还提供保藏编号为CGMCCNO:11086的杂交瘤细胞分泌产生的抗 LGR5蛋白单克隆抗体在制备标记正常干细胞和肿瘤干细胞试剂盒中的应用。
[0020] 作为优选，所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌、皮肤基底细胞癌。
[0021] 作为优选，所述正常干细胞包括正常小肠组织中和胃组织中的干细胞。
[0022] 本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗LGR5蛋白单克隆抗体，且与LGR5蛋 白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了LGR5蛋白免 疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种干细胞和肿瘤干细胞的标记。
[0023] 生物保藏信息说明
[0024] UMAB212,分类命名为富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5 (LGR5)单克隆抗体 杂交瘤细胞株，于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO:11086〇
【附图说明】
[0025] 图1所示为实施例1中克隆位点图；
[0026] 图2所示为实施例2中LGR5蛋白Westernblot检测结果图，以anti-DDK检测 LGR5蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗 原的检测结果、泳道R为转染PCMV6-LGR5质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；
[0027] 图3所示为实施例2中LGR5蛋白SDS-PAGE结果图；
[0028] 图4所示实施例4稳定表达LGR5的活细胞中流式细胞术检测结果图（一抗为 UMAB212分泌产生的LGR5鼠单抗）；图中左边Linel峰线代表阴性对照细胞（293T细胞） 与UMAB212孵育结果；右边Line2峰线代表LGR5阳性细胞系与UMAB212孵育结果；
[0029] 图5所示实施例4瞬时过表达LGR5的活细胞中流式细胞术检测结果图（一抗为 UMAB212分泌产生的LGR5鼠单抗）；其中，图中左边5条线Linel/2/4/5/7分别代表转染空 载体pCMV6-Entry，小鼠LGR4和6,人源LGR4和6 ;中间Line3峰线代表转染鼠源LGR5,右 边Line6峰线代表转染人源LGR5 ;
[0030] 图6所示实施例5小鼠小肠组织中免疫组化检测结果图（一抗为UMAB212分泌产 生