一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体来说涉及一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和 应用。
【背景技术】
[0002] γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricEtcidy-ciminobutcinoic￡icid，间矛尔GABA) 一种功能性氨基酸，广泛分布于动植物及微生物中的一种非蛋白氨基酸，是存在于哺乳动 物脑、脊髓中的抑制性神经传递物质，对生物体生命活动起着不可替代的作用。GABA具有延 缓衰老、降血压、调节激素分泌、治疗癫痫、治疗帕金森病的功能。此外GABA作为中枢神经 系统中的一种重要的抑制性神经递质，还可以镇痛、保肝、活肾、解酒毒、抗脑缺血、抗焦虑、 抗心律失调、治疗哮喘、调节胃酸分泌等功能。2009年9月27日，卫生部批准GABA为新资 源食品，作为新资源食品的GABA，由于化学合成GABA存在较大的安全性问题，不适合应用 于食品的开发。因此，利用生物合成法生产GABA是一条相对安全与有效的途径。
[0003] 目前生物合成法生产GABA均采用微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种，发 酵生产GABA，主要利用的是微生物中自身所含有GABA合成基因。然而利用植物来源的GABA 合成基因生物合成GABA相对很少。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中植物来源的GABA合成基因种类少、合成GABA效 率低的不足，提供一种植物来源的、能高效催化合成GABA的谷氨酸脱羧酶及其编码基因和 应用。
[0005] 申请人研究发现与其他植物相比，厌氧胁迫处理的茶（Camelliasinensis)叶具 有产生高含量GABA的能力，并从茶叶中筛选出了具有高效转化形成GABA的谷氨酸脱羧酶 基因CsGAD，此外还发现谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列会抑制其转化形成GABA的活性，切 除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白（谷氨酸脱羧酶CsGADm)能进一步提高其 生物合成形成GABA的转化率，并最终获得基于植物源基因生物合成形成的GABA。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶CsGAD，其氨基酸序列如SEQID NO. 3所示，其含有493个氨基酸残基。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD的谷氨酸脱羧 酶基因CsGAD。
[0008] 优选，所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其含有 1482bp的碱基。
[0009] 本发明的第三个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶CsGADm，其氨基酸序列如SEQID NO. 4所示，其含有462个氨基酸残基。
[0010] 本发明的第四个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶CsGADm的谷氨酸脱羧 酶基因CsGADm。
[0011] 优选，所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，其含 有1389bp的碱基。
[0012] 本发明的第五个目的是提供所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD和/或谷氨酸脱羧酶 CsGADm在催化生成γ-氨基丁酸（GABA)中的应用。
[0013] 本发明利用序列敲除方法，改造了谷氨酸脱羧酶CsGAD。对谷氨酸脱羧酶CsGAD 的修饰是通过切除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端的31个氨基酸序列而得到谷氨酸脱羧酶 CsGADm，谷氨酸脱羧酶CsGADm的编码基因即谷氨酸脱羧酶基因CsGADm对应为切除了谷氨 酸脱羧酶基因CsGAD的3'端的93bp核苷酸后得到的序列。本发明的谷氨酸脱羧酶CsGAD 具有较高的催化活性，达〇. 99±0. 09mgGABA/mgprotein/min，谷氨酸脱羧酶CsGADm的催 化活性更是大大提高，达1. 67±0. 34mgGABA/mgprotein/min。每50ml经异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷诱导培养的含有重组质粒pET-32a_CsGADm的EscherichiacoliRosetta重组 菌菌液可产生24. 2mg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白，lmg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白 151^11可完成转化35.2811^1^-谷氨酸全部生成6484，转化率达100%。本发明利用植物来 源的谷氨酸脱羧酶生物合成生产γ-氨基丁酸，具有来源安全、工艺简单、转化时间快、转 化率高等优点，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1是重组谷氨酸脱羧酶CsGADm纯化蛋白的SDS-page结果，Marker的单位为 KDa〇
【具体实施方式】
[0015] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0016] 实施例1:
[0017] 申请人研究发现与其他植物相比，厌氧胁迫处理的茶（Camelliasinensis)叶具 有产生高含量GABA的能力，并从茶叶中筛选出了具有高效转化形成GABA的谷氨酸脱羧酶 基因CsGAD，此外还发现谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列会抑制其转化形成GABA的活性，切 除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白（谷氨酸脱羧酶CsGADm)能进一步提高其 生物合成形成GABA的转化率。
[0018] 以下对实施的具体步骤进行说明：
[0019]a)茶叶RNA的提取及cDNA的获得：
[0020] RNA提取用华越洋的超快型植物RNA提取试剂盒GK系列。具体步骤为：取0. 05g用 液氮磨碎的茶（Camelliasinensis)叶加入0. 5ml裂解液，混勾，加入150μ1去蛋白液（取 下层），加入100μ1氯仿，混勾30s，离心（12000Xg)5min，取上清350μ1，加入等体积漂洗 液，颠倒混匀，分两次上柱，离心（12000Xg) 30s，加入500μ1洗柱液，离心（12000Xg) 30s， 重复洗柱步骤，再次离心（12000Xg)lmin，将柱移至新离心管中，加50μ1水，室温静置 3min，离心（12000Xg)lmin，提取得到茶叶RNA，保存于_80°C。
[0021] 将茶叶RNA逆转录成cDNA用TAKARA公司的PrimeScript?RTreagentKitwith gDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒。取出-80°C冻存的茶叶RNA，待融化后，根据说 明书加入DNA酶后，42°C2min消化DNA，再加入反转录试剂，37°C15min，85°C5sec;得到逆 转录的cDNA。
[0022] b)谷氨酸脱羧酶基因CsGAD和修饰后的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD(谷氨酸脱羧酶 基因
[0023] CsGADm)的克隆：
[0024] 利用生物信息学分析方法，根据已知的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计用于扩增谷 氨酸脱羧酶基因CsGAD的引物序列为：F: 5' -GCGGCCGCATGGTTCTGTCAAAGACAACATCG-3' ； R:5' -GTCGACTTAGCAAACACCATTAGTCTTCTT-3'。反应体系参照说明书，PCR扩增用Takara 的PrimeSTARMaxPremix(2X)10yl，F和R引物各ΙΟμΜ，逆转录的cDNA模板(λΙμL， 加双蒸水补足20μ1。PCR扩增程序为98°C30sec，l个循环；98°C15sec，55°C15sec， 72°C30sec，33个循环；72°ClOsec，1个循环。由此扩增得到谷氨酸脱羧酶基因CsGAD全长 序列，把全长序列克隆连接到表达载体pET-32a(含有His标签，Novage