一种环状芽孢杆菌的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵工程和微生物育种的技术领域，涉及一种产β-半乳糖苷酶的环 状芽孢杆菌的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002] 低聚半乳糖主要是以乳糖为原料通过微生物β-D-半乳糖苷酶催化半乳糖基转 移反应来生产的，产物主要是三糖（4'或6'-半乳糖基乳糖）和少量的四、五、六糖。低聚半 乳糖的化学式为（半乳糖）η-葡萄糖，η= 2~4。低聚半乳糖结构上连接半乳糖基与半乳 糖基的糖苷键类型为β(1 - 3)，β(1 - 4)，β(1 - 6)，其中以β(1 - 4)为主。β-D-半 乳糖苷酶可以催化半乳糖基转移至葡萄糖的C2、C3、C6位，生成除了β(1 - 1)之外的所有 可能的糖苷键类型的半乳糖基转移二糖。
[0003] 不同菌种代谢产生的β -半乳糖苷酶作用特异性不同，作用于乳糖后生成的低聚 半乳糖含量和结构不同，这种特异性的差异在不同种类的菌中尤为明显，如环状芽孢杆菌 或罗伦隐球酵母菌生产的β-半乳糖苷酶催化时，半乳糖单元间的糖苷键主要是β(1 - 4) 键，而用米曲霉或嗜热链球菌产生的酶催化，糖苷键主要是β(1 - 6)键。有相关报道证实， 目前已有60多种的低聚半乳糖结构。
[0004] 微生物β -D-半乳糖苷酶易于大量制备、稳定性好。因此，β -D-半乳糖苷酶适合 于生产低聚半乳糖。β-D-半乳糖苷酶来源广泛，不同种类微生物产生的β-D-半乳糖苷 酶不仅表现在分子量、最适pH值、最适温度、热稳定性等酶学性质方面的差异。从自然界直 接分离的菌种，一般而言其酶发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要 根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。为了使酶更适合于实际应用，采取不同的方法、 从不同角度对现有菌种和酶进行改造，以期获得比天然酶更高的活力或不同的催化活性， 提高酶的应用价值。以微生物的出发菌株自然变异为基础的生产选种的概率并不高，仅为 10 6~10 '为了加大其变异率，采用物理和化学因素促进其诱发突变，以提高菌种产量、性 能的主要手段。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能，而且能改进产品的质量、扩大品种和 简化生产工艺等。从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，在 育种方法上，虽然杂交、转导以及基因工程、原生质体融合等方面的研究都在快速地发展， 但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的育种手段。
[0005]目前相关研究报导证明环状芽孢杆菌是半乳糖苷酶的重要来源，且所产 半乳糖苷酶对乳糖具有理想的转化效果。利用环状芽孢杆菌生产半乳糖苷酶具有 显著的应用价值。
[0006] 突变菌株的筛选一般多用筛选培养基在摇瓶中发酵培养，该筛选方法存在筛选工 作量大、筛选效率低等问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种高产β -半乳糖苷酶的环 状芽孢杆菌的高通量筛选方法。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] -种环状芽孢杆菌的高通量筛选方法，包括以下步骤：
[0010] (1)出发菌活化：将环状芽孢杆菌进行划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB培养基 中培养，然后离心收集菌体，重新悬浮于无菌水中；
[0011] (2)紫外诱变：将步骤⑴细胞悬浮液用紫外灯照射；
[0012] (3)氯化理诱变：照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养，并 稀释菌液浓度，红光下涂布于含LiCl的LB平板进行培养；
[0013] (4)菌株的筛选：向步骤（3)中诱变获得的突变株中滴入X-gal溶液，观察菌落的 显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，接种于含有培养基的96孔板；
[0014] (5)将上述96孔板置于摇床中培养，通过检测β-半乳糖苷酶活力进行筛选，得到 F1代；
[0015](6)将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤（2)~（5)，得到高产β-半 乳糖苷酶的环状芽孢杆菌菌株。
[0016] 进一步地，步骤（1)所述环状芽孢杆菌的孢子浓度为105~10 8个/mL。
[0017] 进一步地，步骤（3)所述LiCl的含量是0. 05~l.Owt%。
[0018] 进一步地，步骤（4)所述的X-gal溶液的配制方法为：将20mgX-gal用100mL二 甲基甲酰胺进行漩涡混合溶解，再用锡纸包裹避光，置_20°C保存。
[0019] 进一步地，步骤（4)所述96孔板为2mL深孔板，每孔装液量为500~1200μL。
[0020] 进一步地，步骤（4)所述培养基的组成为：1. 2wt%的大豆蛋白胨、0. 65wt%的酵 母抽提物、〇. 35wt%的磷酸氢二钠、0. 25wt%的碳酸钠、0. 55wt%的硫酸镁、1. 5wt%的乳糖 和95. 50wt%的水。
[0021] 进一步地，该筛选方法包括以下步骤：
[0022] (1)出发菌活化：将环状芽孢杆菌进行划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB培养基 中，30~40°C培养4~12h后，lOOOOrmp离心lOmin收集菌体，重新悬浮于无菌水中；
[0023] (2)紫外诱变：将步骤⑴细胞悬浮液置于距离30w紫外灯25cm处，照射15~ 30min；
[0024] (3)氯化理诱变：照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养2h， 并稀释菌液浓度，红光下涂布于含LiCl的LB平板，30~40°C下培养24h;
[0025] (4)菌株的筛选：向步骤⑶中诱变获得的突变株中滴入0.02wt%的X-gal溶液， 观察菌落的显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，接种于含有培养基的96孔板；
[0026](5)将上述96孔板置于摇床中培养，30~40°C、100~300r/min培养36~48h， 通过检测β-半乳糖苷酶活力进行筛选，得到F1代；
[0027](6)将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤⑵~（5)，重复2~5次， 得到高产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌菌株。
[0028] 本发明具有以下有益效果：
[0029] 本发明的筛选方法可以提升菌株的筛选量，加快菌种选育进程。该筛选方法利用 传统物理与化学相结合的诱变方式，提高菌株的突变机率，综合利用96孔板培养、酶标仪 检测酶活性的高通量筛选方法，提高筛选效率，提高单位时间内样本处理量，加快菌种选育 的进程，筛选出最佳生产菌种。采用高通量筛选方法单次可检测诱变菌株1000株以上，比 常规摇瓶育种（日处理量约40株）的效率提升25倍，为高产β-半乳糖苷酶环状芽孢杆 菌提供高效、简单的筛选方法。
[0030] 96孔培养板作为一种高通量筛选工具在细菌优良菌株选育中未见应用，将96孔 培养板应用于细菌突变菌株的筛选，可有效提高筛选效率，减少筛选工作量，本发明用96 孔培养板对诱变后的环状芽孢杆菌进行高通量筛选，获得高产β-半乳糖苷酶菌株。
[0031] 用本发明方法筛选所得到的环状芽孢杆菌菌株的产酶能力达到40~50U/mL，比 出发菌株提高了 45~60%，具备较高的工业应用价值。
【附图说明】
[0032] 图1是本发明实施例2的F1代诱变菌株酶活力检测结果图；
[0033] 图2是本发明实施例2的F4代诱变菌株酶活力检测结果图。
【具体实施方式】
[0034] 以下实施例中使用的初始菌环状芽孢杆菌（Bacilluscirculars)购自美国 菌种保藏中心（ATCC)，编号为31382。但本发明所用的菌株不限于环状芽孢杆菌ATCC No. 31382,其它环状芽孢杆菌也适用于本发明。
[0035] 实施例2~5所用发酵培养基的组成为：1. 2wt%的大豆蛋白胨、0. 65wt%的酵母 抽提物、〇· 35wt%的磷酸氢二钠、0· 25wt%的碳酸钠、0· 55wt%的硫酸镁、1. 5wt%的乳糖和 95. 50wt%的水；实施例2~5所用X-gal溶液的配制方法为：将20mgX-gal用100mL二甲 基甲酰胺进行漩涡混合溶解，再用锡纸包裹避光，置_20°C保存。