一对用于敲除猪nfkb1基因的向导rna的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一对靶向识别猪NFKB1基因的向 导RNA及其应用。
【背景技术】
[0002] ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技 术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶。而CRISPR/Cas9系统对特 异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异 位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建 (CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展.江苏农业学报.李辉等，2013)。
[0003] (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免 疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。 Cong等(MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems.Science. 2013) 及Mali等(RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science.2013)证 明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组 (NHEJ)、同源重组（HR)效率在3-25 %之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多 个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱靶效 应（High-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbyCRISPR-Casnucleasesin humancells.NatureBiotechnology.Fuetal，2013 ;High-throughputprofilingof off-targetDNAcleavagerevealsRNA-programmedCas9nucleasespecificity.Nature Biotechnology.Pattanayaketal，2013)。麻省理工学院FengZhang团队使用双切刻技 术将Cas9 的特异性提高了 50 倍以上（DoublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9for enhancedgenomeeditingspecificity.Cell.Ranetal，2013)，维护了Cas9 在基因打革巴
技术领域的地位。借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种研究等都得到了迅猛的发 展。
[0004] NFKB1是NFKB转录因子家族重要成员。猪NFKB1基因的多态与猪对沙门氏菌的抵 抗能力相关（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ834921. 1)。由此可见，猪NFKB1 基因可作为猪抗病育种的一个重要候选基因。在细胞或个体水平上对猪NFKB1基因进行敲 除或修饰，可解析猪NFKB1基因的功能，为猪的抗病育种服务。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一对靶向猪NFKB1基因的前导RNA(sgRNA)。本发明利用 编码这对sgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出这对sgRNA， 这对sgRNA能够特异性地识别猪NFKB1基因。本发明还利用这对sgRNA引导Cas9n核酸酶 (即Cas9切刻酶）对猪NFKB1基因进行准确、高效地靶向修饰。
[0006] 具体地，本发明的目的是这样实现的：
[0007] 一对靶向猪NFKB1 基因的sgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R组成；sgRNA-F和sgRNA-R 分别由102个核苷酸组成，其中5'末端第2-21位的RNA片段（20nt，分别命名为sgRNA-F20 和sgRNA-R20)可以识别猪染色体上NFKB1基因的特定序列，其余82nt称为骨架RNA序列。 第22-102位的RNA片段可形成发夹结构，与Cas9n核酸酶结合，从而引导Cas9n核酸酶切 割靶标DNA单链，两个单链切口导致双链断裂（DSB)，细胞利用自身修复功能，使得靶标位 点附近的序列发生变化；另外，这对sgRNA识别的DNA靶序列呈"头对头"的排布方式（即 二者的5'末端相互靠近），二者相距6bp，即有6bp的间隔。
[0008] 所述sgRNA-F具体可如序列表的序列2所示。
[0009] 所述sgRNA-R具体可如序列表的序列4所示。
[0010] 本发明另一个目的在于提供一对DNA分了（命名为特异DNA分子对），由编码所述 sgRNA-F的DNA分子甲和编码所述sgRNA-R的DNA分子乙组成。
[0011] 所述DNA分子甲具体如序列表的序列1所示。
[0012] 所述DNA分子乙具体如序列表的序列3所示。
[0013] 本发明第三个目的是提供上述sgRNA对在特异识别和靶向修饰猪NFKB1基因中的 应用。所述猪NFKB1基因，其GenBank号为DQ834921. 1。
[0014] 本发明第四个目的是提供上述SgRNA对在构建猪NFKB1基因突变库中的应用。所 述猪NFKB1 基因，其GenBank号为DQ834921. 1。
[0015] 与现有技术相比，本发明提供了一对特异识别猪NFKB1基因的SgRNA，并提供了一 对该sgRNA的编码DNA片段，从而通过Cas9系统在细胞或个体水平上对猪NFKB1基因进行 敲除或修饰，以解析猪NFKB1基因的功能、构建猪NFKB1基因突变库，为猪育种服务。
【附图说明】
[0016] 图1为sgRNA靶点设计结果示意图，其中箭头处代表单链切刻位点（两个单链切 口产生一个双链断裂）。
[0017] 图2为质粒对pX335-sgRNA-F与pX335-sgRNA-R共转染猪胎儿成纤维细胞72小 时后提取DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果（突变序列）。
【具体实施方式】
[0018] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培 养细胞。
[0019] pX335载体购自Addgene，货号42335。BbsI内切酶购自NEB公司，货号R0539S。 DNA寡核苷酸均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0020] 实施例1、sgRNA表达质粒对的构建
[0021] 1、sgRNA靶点设计
[0022] 在NCBI登录号为DQ834921. 1的序列中提取猪NFKB1基因第3外显子序列 (115-216bp区域，如下所示），使用麻省理工学院在线软件（http://crispr.mit.edu/)设 计祀标位点。
[0023] 1cagagaggatttcgtttccgttatgtgtgtgaaggcccctcccatggtggactccctggc
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