人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及人TWISTI/Vimentin基因甲基化检测标志物 及试剂盒
【背景技术】
[0002] 膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全 身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于 前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6. 61/10万，列恶性肿 瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加， 高发年龄50~70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3~4倍。临床上膀胱癌具有恶性程度 高、术后复发率高等特点，因此早期诊断对治疗和预防复发有着非常重要的意义，可以增加 保留膀脫的机会并提尚患者总体生存率。
[0003] 众所周知，恶性肿瘤的发生发展是一个多基因作用的多阶段过程。大量研究表明， 有一套特定基因的改变导致并推动了癌症的发生发展：染色体不稳定性、微卫星不稳定性、 表观遗传学改变等。表观遗传是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以 遗传给子代细胞的基因组修饰作用，目前最为人们所知的表观遗传学主要方式是DNA甲基 化。由于DNA甲基化往往发生在膀胱癌发生过程中的早期，很容易在患者的尿液中检测到。 因此，检测尿液中DNA甲基化状态有望成为膀胱癌早期无创诊断的一条新途径。
[0004] 膀胱癌DNA分子甲基化检测组合物一直以来都没有其特有的基因，多数研究是联 合几个基因同时检测尿液中基因甲基化水平，以此来提高灵敏度与特异性。根据最新的文 献报道，研究人员已经通过大规模的基因筛选和样本测序，发现在膀胱癌发生早期尿液脱 落细胞中1-2个基因的甲基化概率明显增加，这为膀胱癌早期辅助诊断提供了可靠的检测 标志物。
[0005] TWIST1是碱性的螺旋-环-螺旋蛋白家族中高度保守的转录因子，其mRNA在胎盘 组织表达量最高，在胚胎发生、发展中发挥重要作用。它参与上皮间质转化过程的调控，进 而影响肿瘤的侵袭与转移。转移性肿瘤中常见TWIST1过表达或启动子的甲基化。目前国 内外涉及膀胱肿瘤与TWIST1基因的相关性研究包括，TWIST1蛋白表达与肿瘤的相关性分 析，以及尿液标本甲基化水平检测。IsabelleRenard等人研究发现，在膀胱癌尿液样本中 TWIST1甲基化的检出率达到88%，特异性达到94%。
[0006] Vimentin是中间丝纤维蛋白家族的一员，在很多方面表现出复杂的基因表达模 式，主要表达于胚胎组织和来源于间叶组织的成体细胞。越来越多的研究表明，Vimentin 的表达不再是间充质起源细胞、向间叶分化的肿瘤细胞的特异性生物标志，它也在乳腺癌、 膀胱癌、子宫内膜癌等上皮源性恶性肿瘤中共同表达，而且与癌细胞的侵袭性强和易转移 密切相关。另有研究证实，与肿瘤癌前病变（如腺瘤）产生相关的Vimentin的表达下调可 能与其启动子的甲基化密切相关，这提示DNA甲基化可以从基因转录水平下调Vimentin表 达，其对于肿瘤细胞迀移具有促进作用。
[0007]目前，膀胱镜检查、对可疑病变组织进行活检以及对尿液进行细胞学检查仍然是 膀胱肿瘤临床最常用的诊断和随访方法。然而，膀胱镜检查是一种侵入性且昂贵的检查方 法，给患者带来痛苦及经济负担；尿液细胞学检查的灵敏度不高，阳性率较低，给临床应用 带来不便。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的膀胱癌检测标志物以及试剂 盒，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放和无创伤性等优点。
[0009] 为达到上述目的，本发明的技术方案是：人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测标 志物，所述人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWISTl、Vimentin和ACTB三种 基因的甲基化引物和探针；
[0010] 所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是：
[0011]
[0012] 〇
[0013] 本发明还提供一种人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所 述人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒包括：
[0014] 提取试剂：尿液保存液、尿液漂洗液、裂解液、提取漂洗液、洗脱液；
[0015] 硫化纯化试剂：硫化试剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化漂洗液1、纯化漂洗液2、 纯化漂洗液3、洗脱液；
[0016]PCR检测试剂：TWIST1PCRMix、VimentinPCRMix、ACTBPCRMix、阴性质控品、阳 性质控品、聚合酶。
[0017] 所述人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒用于检测时的PCR程序如下：首 先95 °C变性5分钟，然后95 °C变性20秒、62 °C退火40秒，并进行45次循环，PCR循环过程 中，仪器升降温速度设定为1. 3°C/S，最后40°C维持30秒。
[0018]所述PCR结果在LighiCycier?.480II上进行TWISTl/Vimentin/ACTB的Cp值分 析，根据空白对照组、阴性质控品、阳性质控品、待测样品的扩增情况，确定试验结果的有效 性并对样本结果进行判读。
[0019] 所述PCR结果的分析具体如下：
[0020] 1)在LjghtCycIcrQD48〇基本软件模块栏中选择"Analysis Overview"；
[0021] 2)选择"AbsQuant/2ndDerivativeMax" 分析模式；
[0022] 3)选择"FilterComb465-510" ；
[0023] 4)点击"Calculate"，软件自动给出目的基因TWISTl/Vimentin的Cp值；
[0024] 5)选择"FilterComb533-580" ；
[0025] 6)点击"Calculate"，软件自动给出内参基因ACTB的Cp值。
[0026] 所述PCR结果的具体判读如下表：
[0027] 若判读结果为阴性，患膀胱癌风险性较低；若判读结果为阳性，患膀胱癌风险较 高，建议镜检确认。
[0028]
[0029] 本试剂盒采用荧光PCR法检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化指标。将待测DNA 样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照进行PCR扩增反应，对检测基因和内参基因进 行双重PCR扩增反应。通过对所述待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照的 参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的检测基因的甲基化情况。
[0030] 本发明选择TWIST1和Vimentin两个基因中的标志片段进行膀胱癌检测，未见于 任何报道，将其作为检测标志物，灵敏度高、特异性强。本发明组合物首次建立TWIST1和 Vimentin双基因联合检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化体系，不仅可以用于膀胱癌早期 诊断，还可以预测术后复发。
[0031] 本发明在较少样本体积（5mL)下进行，依然可得到相同水平的灵敏度和特异性， 可适用于小体积样本的检测。
[0032] 采用本发明检测膀胱癌尿液中TWIST1与Vimentin甲基化情况，具有操作简单、快 速、灵敏度高，特异性好，无创伤等优点，适合于复发率很高的膀胱癌的早期诊断与随访，使 需定期进行膀胱镜检查的患者数量明显减少，具有很高的临床应用价值。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0034] 实施例
[0035] 1、人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测体系
[0036] 样本：人尿液样本、阳性质控品、阴性质控品以及空白对照样本；
[0037] 仪器：Lightcycler480、高速离心机、金属浴、PCR仪、漩涡震荡仪等；
[0038]TWIST1、Vimentin和ACTB三个基因的甲基化引物和探针如下所示：
[0041] 2、人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒
[0042] 2. 1根据确定的反应体系建立的人TWISTl/Vimentin基因提取试剂，具体组分如 下：
[0043]
[0044] 注：*表示粉末，需加入相应体积的溶剂溶解后才能使用；**表示浓缩液，需加入 相应体积的无水乙醇才能使用
[0045] 2. 2根据确定的反应体系建立的人TWISTl/Vimentin基因硫化纯化试剂，具体组 分如下：
[0048] 注：*表示粉末，需加入相应体积的溶剂溶解后才能使用；**表示浓缩液，需加入 相应体积的无水乙醇才能使用
[0049] 2. 3根据确定的反应体系建立的人TWISTl/Vimentin基因PCR检测试剂，具体组分 如下：
[0050]
[0051]
[0052] 2. 4根据确定的反应体系建立的人TWISTl/Vimentin基因质控品试剂，具体组分 如下：
[0053]
[0054] 3、人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒检测过程
[0055] 3. 1、人TWISTl/Vimentin基因DNA提取
[0056] a)试剂准备
[0057] 提取漂洗液：初次使用前加入12mL无水乙醇，振荡混匀。
[0058] b)提取步骤
[0059]3. 1. 1取一支15mL离心管（自备），加入5mL尿液样本，3500rpm离心lOmin，弃掉 上清，保留沉淀；
[0060] 3. 1. 2尿沉淀用500yLPBS(4°C预冷）悬浮分装到1. 5mL离心管中，3500rpm离心 5min(4°C)，弃掉上清；
[0061] 3. 1. 3 重复 1 次步骤 3. 1. 2;
[0062] 3. 1. 4尿沉渣用500μLPBS重悬，加入750μL裂解液，颠倒混匀15次，涡旋震荡 lmin；
[0063] 3. 1. 5将上述混合液转入到已装入收集管的吸附柱中，lOOOOrpm离心lmin，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复操作，将剩余混合液转入吸附柱；
[0064] 3. 1. 6向吸附柱中加入500μL的提取漂洗液，lOOOOrpm离心lmin，倒掉收集管中 的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0065] 3. 1. 7向吸附柱中加入500μL的85%乙醇（自备），lOOOOrpm离心lmin，倒掉收 集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0066] 3. 1. 8重复1次步骤3. 1. 7 ;
[0067] 3. 1. 912000rpm空离2min，彻底去除残余的乙醇，以免其影响后续