马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种RNAi表达载体及其构建方法和应用，尤其涉 及一种马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 马铃薯甲虫（Leptinotarsadecemlineata)属鞘翅目，叶甲科，是世界著名的毁灭 性检疫害虫，原产在美国，后传入法国、荷兰等一些国家，现已广泛分布于欧美和亚洲的40 多个国家，是中国外检对象。寄主主要是茄科植物，大部分是茄属，其中马铃薯是最适寄主， 此外还可危害番茄、茄子、辣椒、烟草等。马铃薯甲虫是一种分布最广、为害最甚的马铃薯害 虫，成虫和幼虫常常将马铃薯的叶片全部吃光，造成马铃薯减产30-50 %，最严重的地方甚 至减产90%左右。现在主要的防治措施还是通过喷洒化学农药，然而，一方面，化学农药的 大量使用导致害虫产生了抗药性；另一方面，农药残留直接危害自然环境和人类的健康。虽 然马铃薯甲虫传入我国才20年左右，但马铃薯甲虫抗药性水平发展很快，研究表明发生区 大部分马铃薯甲虫种群对拟除虫菊酯类（三氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯）杀虫剂普遍产生 中到极高水平的抗性。因此，积极开展马铃薯甲虫生物防治技术的研究与应用，对我国发生 区马铃薯甲虫的危害实施科学有效控制，以及延缓其抗药性产生和抗药性治理具有十分重 要作用。
[0003] RNA干扰（RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，具有高效、特 异、易操作等特点。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被 广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。通过基因干涉来防治马铃薯 甲虫具有绿色、环保、可持续、经济有效等特点，有利于保护人们生命健康，由于RNAi具有 高度的特异性，对非靶标基因或同源性不高的基因没有效果，具有极高的种间特异性，不危 害人类的生命安全。
[0004] TOR (Target of Rapamycin)是一种进化中保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在酵 母、动物、植物中通过整合营养和能量信号来促进细胞的增殖和生长。T0R信号通路在动物 胚胎形成、分生组织激活，植物根和叶的生长、开花、衰老和生命周期的控制中都扮演着关 键作用。近几年研究发现，T0R还具有调节核糖体的生物合成、促进翻译、新陈代谢调节和抑 制自噬的功能。在模式动物线虫、果蝇和小鼠中，T0R基因的缺失能够导致动物胚胎致死， 说明T0R基因是动物体内的必须基因，在动物的生长发育进程中扮演着核心作用。构建T0R 基因的RNAi载体来干扰马铃薯甲虫的TOR基因在马铃薯甲虫中还没有被研究过。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供马铃薯甲虫T0R基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示。提供另一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007] 在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有SEQIDNO: 1或2所示的多核苷酸。
[0008] 在本发明的另一方面，提供一种重组载体，含有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序 列，所述重组载体是以PCR8/GW/T0P0载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接 的EcoR I酶切位点、AsiS I酶切位点、PRBCS3B启动子、Not I酶切位点、SEQ ID N0:1所 示的序列、Sbf I酶切位点、RBCS3B的第2个内含子、BbvC I酶切位点、SEQ ID NO: 1所示 序列的反向互补序列、Asc I酶切位点、TRBCS3B终止子、EcoR I酶切位点。
[0009] 在本发明的另一方面，提供一种马铃薯甲虫T0R基因的RNAi表达载体，所述RNAi 表达载体是以植物表达载体pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连 接的EcoR I酶切位点、AsiS I酶切位点、PRBCS3B启动子、Not I酶切位点、SEQ ID NO: 1 所示的序列、Sbf I酶切位点、RBCS3B的第2个内含子、BbvC I酶切位点、SEQ ID NO: 1所 示序列的反向互补序列、Asc I酶切位点、TRBCS3B终止子、EcoR I酶切位点。
[0010] 在本发明的另一方面，提供一种含有前述马铃薯甲虫T0R基因的RNAi表达载体的 微生物转化体。
[0011] 在本发明的另一方面，提供一种前述的马铃薯甲虫T0R基因的RNAi表达载体的制 备方法，包括如下步骤：
[0012] (⑴合成如SEQIDN0:1和2所示的序列，SEQIDN0:1所示的序列命名 为TOR-RNAi，SEQIDN0:2 所示的序列命名为RBCS3B-IN2,对pCR8/GW/T0P0 载体和 RBCS3B-IN2序列进行酶切连接，获得含有RBCS3B-IN2的载体，命名为pRBCS3B-IN2 ;
[0013] (2)将步骤⑴合成的TOR-RNAi序列和载体pRBCS3B-IN2进行酶切连接得到载体 PRBCS3B-T0RIN2 ；
[0014] (3)将载体pRBCS3B-T0RIN2和TOR-RNAi序列进行酶切连接得到载体 PRBCS3B-T0RRI，pRBCS3B-T0RRI中含有如SeqIDNo:7 所示的序列；
[0015] (4)将pRBCS3B-T0RRI中插入的SeqIDNo:7序列重组到植物表达载体 pEarleyGate303上，得到马铃薯甲虫T0R基因的RNAi表达载体。
[0016] 在本发明的另一方面，提供一种SEQIDN0:1所示的多核苷酸的用途，用于作为制 备特异性干扰马铃薯甲虫基因表达或抑制亚马铃薯甲虫生长的干扰分子的抑制或沉默靶 标。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种SEQIDNO: 1所示的多核苷酸或SEQIDN0:2所 示的多核苷酸或含有SEQIDN0:1或2所示的多核苷酸的载体或含有序列如SEQIDNO:7 所示的重组载体或前述马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体在培育抗马铃薯甲虫的转基 因植物中的应用。
[0018] 本发明的有益效果是：构建了一种针对马铃薯甲虫T0R基因的RNAi载体，实验证 明将该载体转入到马铃薯野生型植株中后，转基因植株对马铃薯甲虫的抗性明显增加，证 明本发明构建的马铃薯甲虫T0R基因的RNAi载体十分有效。本发明对培育抗虫植物具有 重要意义，有很好的应用前景，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生、对维持生态系统的 平衡和可持续发展也具有重大的应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1为载体pRBCS3B-IN2的结构示意图。
[0020] 图2为载体pRBCS3B-T0RRI构建过程示意图。
[0021] 图3为载体pRBCS3B-T0RRI酶切后电泳条带图；其中条带1、2为pRBCS3B-T0RRI 载体用AsiSI和AscI酶切后的产物，条带3、4为pRBCS3B-T0RRI载体用BbvCI和AscI 酶切后的产物。
[0022] 图4为载体pERBCS3B-T0RRI构建过程示意图。
[0023] 图5为转基因马铃薯基因组DNA的PCR检测结果；其中Μ为Trans2kplusDNA marker,P为正对照pRBCS3B-T0RRI质粒，WT为负对照野生型Col-0,1~12为转基因马铃 薯。
[0024] 图6为饲喂马铃薯转基因植株的马铃薯甲虫的食叶量数据图。
[0025] 图7为饲喂马铃薯转基因植株后马铃薯甲虫产卵前幼虫的平均质量数据图。
[0026] 图8为饲喂马铃薯转基因植株后产卵前马铃薯甲虫幼虫的存活率数据图。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028] 主要试剂及生产者：
[0029] 酶EcoRI、AsiSI、BbvCI、AscI、NotI、SbfI均为（NEB公司，美国），pCR8/ GW/T0P0载体（Invitrogen公司，美国），胶回收试剂盒（Takara公司，日本），T4DNA连接 酶（Takara公司，日本），DH5α感受态细胞（Takara公司，日本），质粒提取试剂盒（Takara 公司，日本），农杆菌LBA4404菌株、pEarleyGATE303载体（重庆大学生命科学学院植物分 子育种实验室提供），DNA提取试剂盒（天根公司，中国），去磷酸化试剂盒（Takara公司， 日本），TlBIlS:S:t:art.:⑩TaqDNAPolymerase(全式金公司，中国），GatewayLRClonase enzymemix(Invitrogen公司，美国），质粒DNA提取试剂盒（Takara公司，日本）。本发明 实施例中的各序列合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
[0030] 实施例中