小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种RNAi表达载体及其构建方法和应用，尤其涉 及一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 小菜蛾（Plutellaxylostella)又名小青虫、两头尖，是白菜、油菜、花椰菜、甘蓝、 萝卜等十字花科蔬菜的重要害虫，也是一种在世界上分布广泛的害虫。初龄幼虫仅取食叶 肉，留下表皮，在菜叶上形成一个个透明的斑；3~4龄幼虫可将菜叶食成孔洞和缺刻，严重 时全叶被吃成网状。由于其发生世代多，繁殖能力强，寄主范围广，抗药性水平高，小菜蛾逐 渐取代菜青虫而成为蔬菜第1号害虫，给防治工作带来极大困难。小菜蛾是白菜、油菜、花 椰菜和甘蓝等蔬菜的重要害虫之一，目前主要依赖化学农药进行防治。化学农药（甲氨基 阿维菌素、氟虫腈、溴虫腈、吡虫啉等）的大量使用，一方面使小菜蛾产生了抗药性，用药量 越来越大、抗药性越来越强，形成恶性循环；另一方面蔬菜农药残留直接威胁着人们的生命 健康。据统计，我国有200多个癌症村；我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死 约15万人；同时，胃癌和肠癌在我国也是高发癌症。研究发现，以上癌症的发生主要是由于 化学农药残留造成的。
[0003] 通过基因干涉来防治小菜蛾具有绿色、环保、可持续、经济有效等特点。有利于保 护人们生命健康，由于RNAi具有高度的特异性，对非靶标基因或同源性不高的基因没有效 果，具有极高的种间特异性。小菜蛾基因干涉防治成败的关键是需要找到有效的靶标基 因。关键靶标基因必须具备如下几个特征：1、靶标基因在小菜蛾各个生理小种中高度保守， 通过一个基因干涉片段可以对各种不同小菜蛾的生理小种都能起到干涉作用，即水平抗性 强；2、靶标基因是小菜蛾生长发育的必须基因，一旦受到干涉，小菜蛾便可立即死亡；3、靶 标基因对RNA干涉高度敏感：在小菜蛾体内表达丰度低，低剂量的小RNA即可达到彻底干涉 的目的（垂直抗性）。
[0004]TOR(TargetofRapamycin)是一种进化中保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在酵 母、动物、植物中通过整合营养和能量信号来促进细胞的增殖和生长。T0R信号通路在动物 胚胎形成、分生组织激活，植物根和叶的生长、开花、衰老和生命周期的控制中都扮演着关 键作用。近几年研究发现，T0R还具有调节核糖体的生物合成、促进翻译、新陈代谢调节和抑 制自噬的功能。在模式动物线虫、果蝇和小鼠中，T0R基因的缺失能够导致动物胚胎致死， 说明T0R基因是动物体内的必须基因，在动物的生长发育进程中扮演着核心作用。我们的 研究表明，T0R基因是防治小菜蛾的关键靶标基因，T0R蛋白的第一代和第二代抑制剂可以 显著抑制小菜蛾幼虫的生长发育。构建T0R基因的RNAi载体来干扰小菜蛾的T0R基因在 小菜蛾中还没有被研究过。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供小菜蛾T0R基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所 示。提供另一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0007] 在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有SEQIDNO: 1或2所示的多核苷酸。
[0008] 在本发明的另一方面，提供一种重组载体，含有如SEQIDN0:7所示的核苷酸序 列，所述重组载体是以PCR8/GW/T0P0载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接 的EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、P35S启动子、Notl酶切位点、SEQIDNO: 1所示的 序列、Sbfl酶切位点、ACTIN的第四个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO: 1所示序列的 反向互补序列、AscI酶切位点、T35S终止子、EcoRI酶切位点。
[0009] 在本发明的另一方面，提供一种小菜蛾T0R基因的RNAi表达载体，所述RNAi表达 载体是以植物表达载体pEarleyGate303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的 EcoRI酶切位点、AsiSI酶切位点、P35S启动子、NotI酶切位点、SEQIDNO: 1所示的序 列、Sbfl酶切位点、ACTIN的第四个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO: 1所示序列的反 向互补序列、AscI酶切位点、T35S终止子、EcoRI酶切位点。
[0010] 在本发明的另一方面，提供一种含有前述小菜蛾T0R基因的RNAi表达载体的微生 物转化体。
[0011] 在本发明的另一方面，提供一种前述的小菜蛾T0R基因的RNAi表达载体的制备方 法，包括如下步骤：
[0012] (1)合成如SEQIDN0:1和2所示的序列，SEQIDN0:1所示的序列命名为 TOR-RNAi，SEQIDN0:2 所示的序列命名为 35S-IN4,对pCR8/GW/T0P0 载体和 35S-IN4 序列 进行酶切连接，获得含有35S-IN4的载体，命名为p35S-IN4 ;
[0013] (2)将步骤⑴合成的TOR-RNAi序列和载体p35S-IN4进行酶切连接得到载体 P35S-T0RIN4；
[0014] (3)将载体p35S-T0RIN4和TOR-RNAi序列进行酶切连接得到载体p35S-T0RRI， P35S-T0RRI中含有如SeqIDNo:7序列所示的序列；
[0015] (4)将p35S-T0RRI中插入的SeqIDNo:7序列重组到植物表达载体pEarleyGate 303上，得到小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体。
[0016] 在本发明的另一方面，提供一种SEQIDN0:1所示的多核苷酸的用途，用于作为制 备特异性干扰小菜蛾基因表达或抑制亚小菜蛾生长的干扰分子的抑制或沉默靶标。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种SEQIDNO: 1所示的多核苷酸或SEQIDN0:2所 示的多核苷酸或含有SEQIDN0:1或2所示的多核苷酸的载体或含有序列如SEQIDNO:7 所示的重组载体或前述小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体在培育抗小菜蛾的转基因植物中 的应用。
[0018] 本发明的有益效果是：构建了一种针对小菜蛾T0R基因的RNAi载体，实验证明将 该载体转入到模式植物拟南芥中后，转基因拟南芥植株对小菜蛾的抗性明显增加，证明本 发明构建的小菜蛾T0R基因的RNAi载体十分有效。本发明对培育抗虫植物具有重要意义， 有很好的应用前景，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生、对维持生态系统的平衡和可持 续发展也具有重大的应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1为载体P35S-IN4的结构示意图。
[0020] 图2为载体p35S-T0RRI构建过程示意图。
[0021] 图3为载体p35S-T0RRI酶切后电泳条带图；其中条带1、2为p35S-T0RRI载体用 AsiSI和AscI酶切后的产物，条带3、4为p35S-T0RRI载体用BbvCI和AscI酶切后的 产物。
[0022] 图4为载体pE35S-T0RRI构建过程示意图。
[0023] 图5为转基因拟南芥基因组DNA的PCR检测结果；其中：Μ为Trans2kplusDNA marker，P为正对照p35S-T0RRI质粒，WT为负对照野生型Col-0,1~19为转基因拟南芥。
[0024] 图6为饲喂拟南芥转基因植株的小菜蛾的食叶量数据图。
[0025] 图7为饲喂拟南芥转基因植株后小菜蛾结茧前幼虫的平均质量数据图。
[0026] 图8为饲喂拟南芥转基因植株后结茧前小菜蛾幼虫的存活率数据图。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028] 主要试剂及生产者：
[0029] 酶EcoRI、AsiSI、BbvCI、AscI、NotI、SbfI均为（NEB公司，美国），pCR8/ GW/T0P0载体（Invitrogen公司，美国），胶回收试剂盒（Takara公司，日本），T4DNA连接 酶（Takara公司，日本），DH5α感受态细胞（Takara公司，日本），质粒提取试剂盒（Takara 公司，日本），农杆菌LBA4404菌株、pEarleyGATE303载体（重庆大学生命科学学院植物分 子育种实验室提供），DNA提取试剂盒（天根公司，中国），去磷酸化试剂盒（Takara公司， 日本），TrQinsStairt.i^iTaqDN